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Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる
From 2011.igem.org
LB培地
| bacto tryptone | 10 g |
| bacto yeast evtract | 5 g |
| NaCl | 10 g |
↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する
LBプレート
| LB培地 | |
| bacto-agar | 15 g/l |
↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる
トランスフォーメーション
去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する
今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する
回復培養あり
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した
アルカリミニプレップ
| Solution I | 50 mM グルコース (MW 180) |
| 10 mM EDTA(pH 8.0) | |
| 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) | |
| Solution II | 0.2 N NaOH |
| 1% SDS | |
| Solution III | 3 M 酢酸カリウム |
| 1.8 M 酢酸 |
去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす
今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| ★DNAサンプル入力 | ★入力 |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
| テーブルタグ | テーブルタグ2 | テーブルタグ |
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
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松浪くん、横井川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
★Ex Taqばーじょん！
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下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
MgSO4とddH2Oの使用した量は各自で変更おねがいします！！
★KOD+ばーじょん！
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ゲル電気泳動
ゲル1枚当たりの組成| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
コンピテント細胞の作製
もらったフローチャートをもとにつくりましたが、不安なところがいくつかあるので、違ってたらゆうてください!!!
斜線で訂正してある部分は訂正の値を使いました。
・「OD600＝0.4-0.8」は0.6にしたほうがいいのか？
・「4°Cで10min低速遠心する」は13minなのか？
SOB培地(1 L)
| bacto tryptone | 20 g |
| bacto yeast extract | 5 g |
| 5M NaCl | 2 mL |
| 2K KCl | 1.25 mL |
↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する
Transformation Buffer(TB)
| PIPES | 1.5 g |
| CaCl2H2O | 1.1 g |
| KCl | 9.3 g |
↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解する
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加する
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する
↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する
↓OD
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓氷上で10 min保冷する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
疑問(´・ω・｀)このタイトルはこれでいいんかな？
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xho I)
★XhoⅠばーじょん！
下記の組成に従って反応液を調整する
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★Xba Ⅰ、Nhe Ⅰばーじょんです
下記の組成に従って反応液を調整する
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ligation
下記の組成に従って反応液を調整する
| insert | 0.5 µl |
| vector | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 2.5 µl |
| F4 ligase | 0.5 µl |
| ddH2O | 1.0 µl |
| total 5 µl |
16°C、30minでincubateする
