"
Team:NTNU Trondheim/Journal
From 2011.igem.org
Lab Journal
Thursday 23/6
Lab equipment was prepared: Pipette tips, 1.5 ml tubes, toothpicks, SOC, LA with 100 µg/ml ampicillin/ 100 µg/ml spectinomycin (from 1988). Recipies are given in recipies section.
Friday 24/6
Biobricks were taken out from kit by resuspending them in sterile water followed by transformation to E.coli DH5 alpha. The biobricks that were taken out are given below:
| Abbreviation | Name | Part number | Resistance |
|---|---|---|---|
| P1 | rrnB P1 | BBa_K112118 | Spec |
| lambda pR | lambda pR mod | BBa_R0051 | Amp |
| RFP | TetR + p(TetR)+RFP | BBa_K092600 | Amp |
| Lux | TetR + p(TetR)+RFP+luxI | BBa_K092700 | Amp |
Saturday 25/6
Plates with transformants were moved to fridge.
Sunday 26/6
Transformants were inoculated in 3 ml LB + proper antibiotics to prepare for isolation of plasmid.
Monday 27/6
Plasmids that contained P1, lambda pR, RFP and Lux biobricks were isolated by using miniprep kit from Promega.
Consentrations of the biobricks were measured and were as follows:
| Biobrick | Consentration (ng/µl) |
|---|---|
| P1 | 98.4 |
| lamda pR | 43.8 |
| RFP | 141.8 |
| Lux | 62.8 |
Konsentrasjoner:
P1 98,4 ng / µL lambda Pr: 43,8 ng / µL RFP 141,8 ng / µL Lux 62,8 ng / µL
Transformantene med lux/RFP var verken røde eller lysende. Det ble foreslått at dette kunne være pga. mulig ekspresjon av tetR som er repressor for pTet som styrer ekspresjon av RFP/lux. Denne antagelsen ble bekreftet av erfaringer som er gjort av tidligere grupper med samme konstrukt.
Siden tetR sin påvirking på pTet blir inhibert av Tc(tetracyclin) prøvde vi å gro cellene i subletale konsentrasjoner av Tc.
E. coli med plasmid med RFP-konstruktet ble grodd i 0 0,1 0,3 0,6 1,0 1,5 og 100 µg/ml Tc i 3 ml LB.
Måling av fluorescens:
Hanne Jørgensen kan ordne dette, dersom vi gror kultur med RFP-uttrykk og uten (blank kontroll). Hun må også bli informert om bølgelengde for exitation (584 nm) og emission (607 nm).
mail : hanne.jorgensen@biotech.ntnu.no
Tirsdag 28 juni
Jon Har Bursdag! Jippi!! Hoi Hoi Hoi!!
Ligering av lambda pR inn i backbone:
· Kutte RFP og RFP + luxI construct med EcoRI og XbaI.
· Kutte lambda pR med EcoRI og SpeI
· Ligate them bitches – win
Kuttet RFP, Lux og Lambda Pr promotor ved bruk av iGem sin protokoll. http://partsregistry.org/Help:Protocols/Restriction_Digest
Alternativ design av system som skal gjøre cellene røde ved tilsats av ppGpp:
