"
Team:NTNU Trondheim/Journal
From 2011.igem.org
Lab Journal
Thursday 23/6
Lab equipment was prepared: Pipette tips, 1.5 ml tubes, toothpicks, SOC, LA with 100 µg/ml ampicillin/ 100 µg/ml spectinomycin (from 1988). Recipies are given in recipies section.
Friday 24/6
Biobricks were taken out from kit by resuspending them in sterile water followed by transformation to E.coli DH5 alpha. The biobricks that were taken out are given below:
| Abbreviation | Name | Part number | Resistance |
|---|---|---|---|
| P1 | rrnB P1 | BBa_K112118 | Spec |
| lambda pR | lambda pR mod | BBa_R0051 | Amp |
| RFP | TetR + p(TetR)+RFP | BBa_K092600 | Amp |
| Lux | TetR + p(TetR)+RFP+luxI | BBa_K092700 | Amp |
P1 rrnB P1 BBa_K112118
lambdaPR lambda pR mod BBa_R0051
RFP TetR + p(TetR)+RFP BBa_K092600
Lux TetR + p(TetR)+RFP+luxI BBa_K092700
rrnB P1, lamda pR, RFP og Lux. Prosedyre gitt i Prosedyrer / Oppskrifter.
Lørdag 25. juni Flyttet plater til kjøleskap.
Søndag 26. juni
De fire Biobrickene (p1, lamda pR, RFP og Lux) ble inokulert i 3mL LB for isolering av plasmid.
Mandag 27. juni
Plasmid ble isolert fra P1, lamda pR, RFP og Lux Biobrickene ved bruk av promega miniprep kit.
Konsentrasjoner:
P1 98,4 ng / µL lambda Pr: 43,8 ng / µL RFP 141,8 ng / µL Lux 62,8 ng / µL
Transformantene med lux/RFP var verken røde eller lysende. Det ble foreslått at dette kunne være pga. mulig ekspresjon av tetR som er repressor for pTet som styrer ekspresjon av RFP/lux. Denne antagelsen ble bekreftet av erfaringer som er gjort av tidligere grupper med samme konstrukt.
Siden tetR sin påvirking på pTet blir inhibert av Tc(tetracyclin) prøvde vi å gro cellene i subletale konsentrasjoner av Tc.
E. coli med plasmid med RFP-konstruktet ble grodd i 0 0,1 0,3 0,6 1,0 1,5 og 100 µg/ml Tc i 3 ml LB.
Måling av fluorescens:
Hanne Jørgensen kan ordne dette, dersom vi gror kultur med RFP-uttrykk og uten (blank kontroll). Hun må også bli informert om bølgelengde for exitation (584 nm) og emission (607 nm).
mail : hanne.jorgensen@biotech.ntnu.no
Tirsdag 28 juni
Jon Har Bursdag! Jippi!! Hoi Hoi Hoi!!
Ligering av lambda pR inn i backbone:
· Kutte RFP og RFP + luxI construct med EcoRI og XbaI.
· Kutte lambda pR med EcoRI og SpeI
· Ligate them bitches – win
Kuttet RFP, Lux og Lambda Pr promotor ved bruk av iGem sin protokoll. http://partsregistry.org/Help:Protocols/Restriction_Digest
Alternativ design av system som skal gjøre cellene røde ved tilsats av ppGpp:
