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Team:KIT-Kyoto/nakagawa9月
From 2011.igem.org
9/1
(目的)
ベクターのゲル抽出、GFP改良版のPCR
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| 提出用ベクターPsb1C3 | 50μl |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
GFPのフレームシフトが懸念されたのでその不安材料をのぞくために新たなプライマーを作成しPCRにかけた
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上記の組成に従って混ぜた
(結果)
ゲル抽出の時に現れたバンドがベクターが約2kbなのであるべき場所にあることが分かった
PCRに関しては翌日電気泳動で確認したところあるべきバンドが出ていたので成功しているといえた
9/2
(目的)
GFPのフェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理
フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した
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(結果)
GFPはあるべき場所で出ていたしフェノクロ処理後のバンドも濃度としてははっきりしていたので充分採れていたのでよかった 9/3
(目的)
GFPのゲル抽出
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| GFP | 50μl |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
9/5
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションとトラフォ
(方法)
昨日精製したGFPとベクターのライゲーションを行った。それぞれの濃度は19ng/μlと25ng/μlであった
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
| insert | 0.5 µl |
| vector | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 2.5 µl |
| F4 ligase | 0.5 µl |
| ddH2O | 1.0 µl |
| total 5 µl |
16°C、30minでincubateしたBR> そしてライゲーションがすんだ菌液をプレートにコンピテントセルを加えて形質転換を行わせることにした
ライゲーション菌液のトランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した
(結果)
コロニーは全く生えていなかった。だが昨年度もライゲーションは成功確率が低いということでインサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを決行することに決めた
9/6
(目的)
二回目のGFPとベクターのライゲーション
(方法)
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
| insert | 0.5 µl |
| vector | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 2.5 µl |
| F4 ligase | 0.5 µl |
| ddH2O | 1.0 µl |
| total 5 µl |
16°C、30minでincubateした
↓ただ今回は工夫点としてベクターとインサートの濃度比を1:9にしてみた
↓そして昨日と同様にトラフォを行うことにした
トランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した
(結果)
翌日4つのコロニーの生成を確認することができた、そのコロニーの数はライゲーションのコロニー数としてはおかしなものではないと聞いていたので期待が高まった。
9/7
(目的)
昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャーとMLFのPCRと制限酵素処理とベクターの植菌
(方法)
昨日のライゲーションで4つのコロニーができていたのでプレカルチャーを行うことにした
↓昨日増やした提出用ベクターとGFPのコロニーを取りだした
↓そこにコロニーのふたにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじでコロニーを突っついた
↓LB液体培地2mlとクローラムフェニコール2μlを合わせた容器につまようじを入れた
↓これを6本分行った
↓一晩振とう培養をした
それと同時進行で白血病の原因タンパクを作るとされているMLFをPCRで増やすことを行った PCR(MLF)
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そしてその後にPCR産物を制限酵素処理することにした
制限酵素処理(MLF)
下記の組成に従って反応液を調整した
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9/8 (目的)
MLFのゲル抽出、ライゲーションの相談、昨日のベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
MLFのゲル抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| MLF | 50μl |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
提出用ベクターのアルカリミニプレップ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した
↓プレートからシングルコロニーを分離した
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心した
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養した
制限酵素処理(提出用ベクター)
下記の組成に従って反応液を調整した
(1)
| MilliQ | 50 µl |
| EcoRⅠ | 1 µl |
| PstⅠ | 1 µl |
| 10 x H Buffer | 6 µl |
| total 58 µl |
37°Cで20時間静置した
(結果)
MLFのバンドは見えなかった。そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。
9/9
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
(方法)
まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。
インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題
そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか
制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか
そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
(結果) エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
よって再度プレカルチャーの方をあす以降進めていくことになった
9/12
(目的)
大腸菌のプレカルチャー、GFPのPCRのフェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日全ての素材を失ってしまったのでもう一度両方の素材を作り直すことにした
大腸菌をまずは殖菌することにした
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
GFPの方ももう一度PCRからやり直すことにした
PCR
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上記の組成に従って混ぜた
フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
制限酵素処理
下記の組成に従って反応液を調整した
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(結果)
9/13
(目的)
二回目の大腸菌のプレカルチャー、GFPのゲル抽出
(方法)
昨日の大腸菌のプレカルチャーは菌液が増えなかったのでもう一度同じことをすることにした。
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
