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9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 1kb/min +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62゜C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA Tm値
66.4゜C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

vector PUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl2H2O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。
9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。 ↓OD600＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓氷上で10 min保冷する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する

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