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From 2011.igem.org

9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 1kb/min +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62゜C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA Tm値
66.4゜C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

vector PUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。




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