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Team:KIT-Kyoto/matsunami
From 2011.igem.org
8月8日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
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下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4゜C
増幅サイズ 約1514 bp
・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値 57.8゜C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5゜C
増幅サイズ 約3131 bp
8月9日（火）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。
【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST 1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。
8月10日（水）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
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下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。
【目的】
大腸菌の培養
【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。
8月11日（木）
松浪
【目的】
pUAST flag vectorの大量精製
【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution 100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月12日（金）
松浪、横井川
【目的】
pUAST flag vectorの大量精製
【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70% EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。
↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH2O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH2O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
| 0.189 | 0.208 | 0.192 | 0.190 | 0.191 |
| 0.282 | 0.276 | 0.278 | 0.269 | 0.269 |
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月15日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
|
|
下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月16日（火）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
|
|
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月17日（水）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 50.5℃
API2-MALT1 53.5℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
８/23(火)
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
KOD+ polymelase 1 µL
10 x Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 5 µL
F primer(10 µM) 1.5 µL
R primer(10 µM) 1.5 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 33 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃ 15 sec
・DIAP2
Annealing 50.5 ℃ 30 sec
Extension 68 ℃ 1 min 40 sec
・API2-MALT1
Annealing ℃ 30 sec
Extension 68 ℃ 3 min
<3> 72℃ 10 min
<4> 4℃ ∞
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月24日（水）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月25日（木）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
・API2-MALT1
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
・DIAP2
（1）PCR反応液の調製()
<1本分あたり>
KOD+ polymelase 1 µL
10 x Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 5 µL
F primer(10 µM) 1.5 µL
R primer(10 µM) 1.5 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 33 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 50.5 ℃ 30 sec
Extension 68 ℃ 1 min 40 sec
<3> 4℃ ∞
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月12日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
KOD+ polymelase 1 µL
10 x Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 5 µL
F primer(10 µM) 1.5 µL
R primer(10 µM) 1.5 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 33 µL
上記の分量を混合した。
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer : Tm値
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT 62 ℃
R primer :
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA 66.4 ℃
増幅サイズ 約1514 bp
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 50.5 ℃ 30 sec
Extension 68 ℃ 1 min 40 sec
<3> 4℃ ∞
上記の条件でPCRを行った。
9月13日（火）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月14日（水）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
＊<プライマーの塩基配列>
・API2-MALT1
F primer : Tm値
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT 57.8 ℃
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA 56.5 ℃
増幅サイズ 約3131 bp
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月15日（木）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
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各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer : Tm値
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT 62 ℃
R primer :
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA 66.4 ℃
増幅サイズ 約1514 bp
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
EtBr染色を行い、写真を撮った。
【目的】
PCR産物の制限酵素処理
【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。
下記の組成に従って反応液を調整した。
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9月16日（金）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の制限酵素処理
【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。
下記の組成に従って反応液を調整した。
