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Team:KIT-Kyoto/yokoigawa
From 2011.igem.org
8/29(月)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）
【実験操作】
～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～
↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
～制限酵素処理～
フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した
反応液調整（cDNA）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector(500ng/μl) 10μl
milliQ 34μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
8/30(火)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)
【実験操作】
制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う
↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
下記の反応液を調整する
反応液調整（DIAP2）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x M Buffer 5μl
Xba 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xba 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
8/31(水)
武田、横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
～反応液の電気泳動～
SeaKemRGTGRのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。
↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）
↓50V60minで電気泳動した。
↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。
↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。
↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVを点灯させてナイフで切り出した。
↓ゲルの重さを測定
～DNA精製（QIAquick Gel Extraction kitを使用）～
ゲルの重さに対して三倍量のBufferQGを加え、50℃のウォーターバスでincubate(約10min)。
↓isopropanolをゲルの重さと等量加えて混ぜた。
↓精製カラムに溶液をセットし遠心した。下段に排出された溶液は廃棄。
↓BufferQG500μlをカラムにセットし遠心した。下段に排出された溶液は
廃棄。
↓BufferPE750μlをカラムにセットし遠心した。下段に排出された溶液は
廃棄。
↓カラム本体を新しいチューブにセット、milliQ37μlを加えて遠心した。
↓ 下段の新しいチューブに精製されたDNA in milliQ約35μlができた。
～DNA濃度の測定～
milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。
【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375ng/μlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。
9/1(木)
武田
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたDIAP2の増殖
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
KOD+ polymelase
1 µL
10 x
Buffer 2
µL
dNTP(2.0
µM) 5
µL
F primer(10
µM)
1.5 µL
R primer(10
µM)
1.5
µL
Templet
DNA
1 µL
milliQ 33 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃ 15
sec
Annealing 50.5 ℃ 30
sec
Extension 68
℃
1 min 40 sec
<3>
4℃
∞
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ
8 µL
6 x loading dye 2
µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動し
た。泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
9/5(月)
横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）
【実験操作】
～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～
↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で
遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ
中にDNAを溶解させる。
～制限酵素処理～
フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した
反応液調整（cDNA）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
9/6(火)
横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)
【実験操作】
制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う
↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で
遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
下記の反応液を調整する
反応液調整（DIAP2）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x M Buffer 5μl
Xba 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xba 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
9/7(水)
横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
～反応液の電気泳動～
SeaKemRGTGRのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。
↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）
↓50V60minで電気泳動した。
↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。
↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。
↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。
【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。
9/13(火)
松浪、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）
【実験操作】
～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～
↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
～制限酵素処理～
フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した
反応液調整（cDNA）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector(500ng/μl) 10μl
milliQ 34μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
9/14(水)
松浪、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)
【実験操作】
制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う
↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
下記の反応液を調整する
反応液調整（DIAP2）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x M Buffer 5μl
Xba 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xba 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
9/15(木)
松浪、横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
～反応液の電気泳動～
SeaKemRGTGRのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。
↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）
↓50V60minで電気泳動した。
↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。
↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。
↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。
【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。
9/17(土)
横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)
【実験操作】
下記の反応液を調整する
反応液調整（DIAP2）
PCR産物 in TE 44μl
10x M Buffer 5μl
Xba 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
9/18(日)
横井川
【目的】
LB培地づくり
【実験操作】
↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う
↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
～反応液の電気泳動～
SeaKemRGTGRのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。
↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）
↓50V60minで電気泳動した。
↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。
↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。
↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。
【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。
