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From 2011.igem.org

かんたん９月

★OK★
9/1(木)
中川

QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出した。

泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。

抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

濃度測定は吸光度計を用いて測った。
その際、吸光度は5回の平均値を算出したものを用いた

1回目	0.019
2回目	0.013
3回目	0.019
4回目	0.022
5回目	0.016
ave.	0.0178

よって濃度は17.8ng/µlと算出された



8/30に再設計したプライマーを用いてPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 48.5°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

9/2(金)★OK★
中川

・昨日のPCR産物のフェノクロ処理をおこなった。
・PCR産物の増幅を確認するため電気泳動を行った。
・制限酵素処理


制限酵素処理は、下記の組成に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)

★制限酵素処理の表が謎！！！！！！！！！！！！！★

cDNA GFP in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl Pst1,EcoRⅠ 1 µl   total 51 µl

(結果)
GFPはあるべき場所で出ていたしフェノクロ処理後のバンドも濃度としてははっきりしていたので充分採れていたのでよかった





9/3(土)★おｋ★
中川
GFPのバンド部分をゲルから切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。

【実験方法】
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した

【結果】
★9/3の切り出しの写真があったので吉村さんに渡す★








9/5(月)★おｋ★
中川

pSB1C3と開始コドン抜きGFPのライゲーションと形質転換
【目的】
新しいiGEMパーツの製作

【実験方法】
昨日精製したGFPとpSB1C3のライゲーションを行った。
それぞれの濃度は19 ng/µlと25 ng/µlだった。
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した

BBa_E0240	0.5 µl
pSB1C3	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH2O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、形質転換を行った。


【結果】
コロニーは全く生えていなかった。
だが昨年度もライゲーションは成功確率が低いということでインサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションをすることに決めた。





9/6(火)★おｋ★
吉村、中川

pSB1C3と開始コドン抜きGFPのライゲーションと形質転換
【目的】
新しいiGEMパーツの製作

【実験方法】
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH2O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした
今回はベクターとインサートの濃度比を1:9にしてライゲーションを行った。
昨日と同様にトラフォを行うことにした

トランスフォーメーション


【実験結果】
4つのコロニーが確認できた。



プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。

【実験方法】
ｐUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。


【実験結果】
F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:72.14℃　38塩基

R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
　　　　　PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:72.16℃　40塩基





9/7(水)★おｋ★
中川
(目的)
・昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャーをした。
・MLFのPCRと制限酵素処理
・pSB1C3のプレカルチャー
(方法)
昨日のライゲーションで4つのコロニーができていたのでプレカルチャーを行うことにした



それと同時進行で白血病の原因タンパクを作るとされているMLFをPCRで増やすことを行った PCR(MLF)

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl MLF 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cyle Anneling 48.6°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

そしてその後にPCR産物を制限酵素処理することにした
制限酵素処理(MLF)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl Pst1,EcoRⅠ 1 µl   total 51 µl

37°Cで20時間静置した






9/8(木)
中川
(目的)
・MLFのゲル抽出 ・ライゲーションの相談 ・昨日のベクターのアルカリミニプレップ ・フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
MLFのゲル抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した



提出用ベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理をしたのち乾燥させたDNAに50μlのTEに溶かした
そののち制限酵素処理をした

制限酵素処理(提出用ベクター)
下記の組成に従って反応液を調整した

提出用ベクターpSB1C3in ddH2O	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 58 µl

37°Cで20時間静置した

(結果)
MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。







9/9★おｋ★
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
(方法)
まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。
インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題
そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか
制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか

そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した

(結果) エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
よって再度プレカルチャーの方をあす以降進めていくことになった

9/12(月)

吉村、中川


PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。

PCR条件(1) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep

PCR条件(2) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く


(目的)
大腸菌のプレカルチャー、GFPのPCR,フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日全ての素材を失ってしまったのでもう一度両方の素材を作り直すことにした

大腸菌をまずは殖菌することにした
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する

GFPの方ももう一度PCRからやり直すことにした

PCR

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl GFP 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 48.5°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

上記の組成に従って混ぜた
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA GFP in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl Pst1,EcoRⅠ 1 µl   total 51 µl

(結果)
大腸菌の方は翌日順調に増えていた、しかし大腸菌の色が明らかに違うものも混じっていた
もしかしたらプレート自体に劣化が始まっているのかもしれない
PCRにいたっては順調に増えていた





9/13(火)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。

【実験方法】

【結果】
泳動後の写真

PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。


Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる

【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
10 x H Buffer	3 µl
	total 30 µl

(2)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

(3)

MilliQ	6 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。


【結果】
泳動後の写真

Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。

【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーのラダーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。

PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く


9/13
(目的)
再度GFPのPCR、ベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日行ったGFPのPCRを行った量ではこの後の失敗が起こった時に心もとないということで保管する名目で再度PCRを行った

PCR

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl GFP 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 48.5°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

上記の組成に従って混ぜた
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA GFP in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl Pst1,EcoRⅠ 1 µl   total 51 µl

次に同時進行でベクターの方は菌が増えていたのでアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理を行った フェノクロ処理後は
制限酵素処理(ベクター)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA ベクター in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl Pst1,EcoRⅠ 1 µl   total 51 µl

(結果)
GFPの方は昨日同様に成功しているといえた、そしてベクターの方も順調に増えていたので無事にDNAを回収できた




9/14(水)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。


【結果】
泳動後の写真

ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れることがなかった。
Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。


9/14
(目的)
GFP、提出用ベクターのゲル抽出
(方法)

QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからGFP、ベクターのDNAを抽出した。

その後吸光度計を使って濃度の測定をした。

GFPの濃度測定

1回目	0.158
2回目	0.147
3回目	0.160
4回目	0.159
5回目	0.158
ave.	0.156

提出用ベクターの濃度測定

1回目	0.029
2回目	0.021
3回目	0.028
4回目	0.022
5回目	0.025
ave.	0.025

GFPのゲル抽出写真



ベクターのゲル抽出の写真


(結果)
ゲルからの抽出はGFPは成功して吸光度計での測定で156ng/µlを記録した、そしてベクターの方は薄いながらも25ng/μlとなり材料がそろった
そこで翌日から再度ライゲーションの実験に入ることにした















































































9/17(土)

吉村・横井川

ライゲーション



9/19(月)
トランスフォーメーション

【目的】


【実験方法】 ↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振とう培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

【結果】



制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる。

【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
10 x H Buffer	3 µl
	total 30 µl

(2)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

(3)

MilliQ	6 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

37゜Cで18時間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。

ゲル1枚当たりの組成

SeaKemRGTGR-agar	0.4 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した


【結果】
泳動後の写真

Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。



9/20(火)

アルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からプラスミドDNAを回収、精製する。

【実験方法】

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

↓前日にプレカルチャーした1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつした
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁した
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心した
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとった
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てた
↓1 mlの70%エタノールを加えた
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かした

【結果】


トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3のバックグラウンドチェック

【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

【結果】


ライゲーション
【目的】


【実験方法】

【結果】
どのプレートにも無数のコロニーが生えていた。


9/22(木)

ライゲーション
【目的】


【実験方法】


【結果】


9/23(金)

トランスフォーメーション
【目的】


【実験方法】


【結果】