Team:KIT-Kyoto/nakagawa9月

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9/1
(目的)
ベクターのゲル抽出、GFP改良版のPCR
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー3 ml
提出用ベクターPsb1C350μl
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

GFPのフレームシフトが懸念されたのでその不安材料をのぞくために新たなプライマーを作成しPCRにかけた

PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling48.5°C1min
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

上記の組成に従って混ぜた
(結果)
ゲル抽出の時に現れたバンドがベクターが約2kbなのであるべき場所にあることが分かった
PCRに関しては翌日電気泳動で確認したところあるべきバンドが出ていたので成功しているといえた

9/2
(目的)
GFPのフェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理

フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Pst1,Ecoli11 µl
 total 51 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Pst1,Ecoli11 µl
 total 51 µl
37°Cで20時間静置した
(結果)
GFPはあるべき場所で出ていたしフェノクロ処理後のバンドも濃度としてははっきりしていたので充分採れていたのでよかった 9/3
(目的)
GFPのゲル抽出
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
GFP50μl
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
9/5
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションとトラフォ
(方法)
昨日精製したGFPとベクターのライゲーションを行った。それぞれの濃度は19ng/μlと25ng/μlであった
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
insert0.5 µl
vector0.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl

16°C、30minでincubateしたBR> そしてライゲーションがすんだ菌液をプレートにコンピテントセルを加えて形質転換を行わせることにした

ライゲーション菌液のトランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した

(結果)
コロニーは全く生えていなかった。だが昨年度もライゲーションは成功確率が低いということでインサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを決行することに決めた

9/6
(目的)
二回目のGFPとベクターのライゲーション
(方法)
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
insert0.5 µl
vector0.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl

16°C、30minでincubateした
↓ただ今回は工夫点としてベクターとインサートの濃度比を1:9にしてみた
↓そして昨日と同様にトラフォを行うことにした

トランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した

(結果)
翌日4つのコロニーの生成を確認することができた、そのコロニーの数はライゲーションのコロニー数としてはおかしなものではないと聞いていたので期待が高まった。

9/7
(目的)
昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャーとMLFのPCRと制限酵素処理とベクターの植菌
(方法)
昨日のライゲーションで4つのコロニーができていたのでプレカルチャーを行うことにした

↓昨日増やした提出用ベクターとGFPのコロニーを取りだした
↓そこにコロニーのふたにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじでコロニーを突っついた
↓LB液体培地2mlとクローラムフェニコール2μlを合わせた容器につまようじを入れた
↓これを6本分行った
↓一晩振とう培養をした

それと同時進行で白血病の原因タンパクを作るとされているMLFをPCRで増やすことを行った PCR(MLF)
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cyle
Anneling48.6°C1min
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

そしてその後にPCR産物を制限酵素処理することにした
制限酵素処理(MLF)
下記の組成に従って反応液を調整した
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Pst1,Ecoli11 µl
 total 51 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Pst1,Ecoli11 µl
 total 51 µl
37°Cで20時間静置した
9/8 (目的)
MLFのゲル抽出、ライゲーションの相談、昨日のベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
MLFのゲル抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
MLF50μl
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

提出用ベクターのアルカリミニプレップ

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