"

From 2011.igem.org

8/22

トランスフォーメーション

↓氷上でコンピテント細胞（DH5 Alpha 大腸菌体）解凍

↓前もって冷やしておいた1.5mlチューブに100μlのコンピテント細胞を分注する

↓DNAをチューブに1~5μl加えて氷上で30分正確に冷やす

↓42℃で45秒熱ショックを与える

↓0.1mlをLBプレート（+amp）にまく

↓37度で一晩培養

8/23

PCRプライマー設計　プレカルチャー

大腸菌のベクターにはEXSPの制限酵素で切れる場所がありEX DNA SPとなる

今回はまずEが2~3Xが2~3でS3でP何塩基でもつけてよい。そしてGFPにつなげる上で15塩基必要なのでその条件で設計する。

またプライマー設計においてもう片方はアンチコドンで設計する必要がある。

そしてプライマー作成サイトでは温度が65度を超えないように注意する

培養がうまくいっていたのでコロニーにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじで突っつくこれを6本分し、2mlずつLBの液体培地に入れて37℃で一晩培養（+amp）

8/24

アルカリミニプレッツ（プラスミド回収）

昨日の大腸菌が増えた菌液を取り出し1.5mlチューブに1.4ml程度入れる。その後15000pm,5min,4℃で遠心

上澄みを廃棄しglucose solution(sol1)を100μｌ加えてvoltex

沈殿物を溶かした後0.2NNaCl1%SDS200μｌ加えてよく混ぜる

その後氷上5分

氷冷した3Mの酢酸カリウムをいれて氷上五分

15000rpm10min4℃で遠心

上澄みを新しいチューブに移す　入れてvoltex

900μlの2‐プロパノールを加え混ぜて、二分待つ

15000rpm,4℃,10分で遠心し、上澄みを捨てる

１mlの70%エタノールを加え15000rpm,2分,4℃で遠心する

沈殿物を乾かす

電気泳動

6本の乾燥ＤＮＡにwilliQ0.3ml DNA5μｌEcoR10.5μｌPst10.5μｌ10×Buffer 0.7μｌ

加え37℃30分インキュベート

１%agaゲル20μlより0.2gのagaを使いそこにTMNを20ml加えてゲルとする

電子レンジで沸騰させて粒がなくなった後約20分待つ

1kbaseのマーカー5μlとDNAのマーカー(×6)1μlとサンプル5μlとを足したもので計七個のサンプルをゲルの穴に注ぐ

電気泳動　100V 30分

EtBr染色(手袋をつけて)　10分

撮影

8/25

LBプレートの作成　PCR フェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理

PCR

フェノクロ処理

前回泳動した残りサンプルを合わせて135μlにする

milliQ65μl加えて全量を200μlにする

フェノール/クロロホルムを等量入れる

しっかりvoltexして、15000rpm,5分,25℃で遠心する

水層を別のエッペンに入れる（下の層がフェノール層）

次にクロロホルムのみで同様におこない、水層を別のエッペンに移す

1/10等量の3M酢酸ナトリウムを加える

等量のイソプロパノールを加え、よく振る

12000rpm,20分25℃で遠心する

沈殿をとらないように上澄みだけ除く

70%エタノールを200μl加える

軽く混ぜた後12000rpm,10分,25℃で遠心

上澄みを除いた後乾燥させて長期保存ならTE、すぐに使うならmilliQ50μlに溶かす

制限酵素処理

先ほどのDNA溶液50μlと切りたい場所の制限酵素（今回はPst1,EcoR1）を1μl、Bufferを使用する制限酵素にあわせたものを6μl（今回は10×H Buffer）、milliQ2μlを混ぜたものを37℃でインキュベートする

8/26

GFPゲル抽出

8/28

大腸菌のコンピテント細胞に提出用ベクターPsb1c3を入れてインキュベート

材料

大腸菌のコンピテント細胞　100μl

クロラムフェ二コール　　　10μl

LBプレート

大会提出用ベクターpSB1C3 1μl

方法

↓提出用ベクターpSB1C3の培養

↓クリーンベンチにて大腸菌のコンピテント細胞を1.5mlのチューブに取る

↓そこにクロラムフェ二コールを10μlとpSB1C3を1μl加える

↓それをLBプレートにまき、ガラス棒でのばす

↓37℃で一晩インキュベートする

結果

小さいながらもコロニーを確認することが出来た

8/29

大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(一回目)

材料

スクリュービン6本

つまようじ6本

8/29のコンピテント細胞を増やしたLB培地

LB液体培地　12ml

クロラムフェ二コール　12μl

方法

↓クリーンベンチにて昨日のプレートにマジックでコロニーに6つ印を入れる

↓スクリュービン一本に液体培地2ml、クロラムフェ二コール2μl加えたものを6本作る

↓火であぶったつまようじで先ほど印をつけたコロニーをつつきスクリュービンに入れるこれを6本分行う

↓その後37℃で一晩インキュベートする

結果

翌日コンタミしてると考えられるビン3本培養に成功したビンが3本できた

ただ念を入れて翌日同じ操作を行うことにした

8/30

大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(二回目)

材料

スクリュービン6本

つまようじ6本

8/29のコンピテント細胞を増やしたLB培地

LB液体培地　12ml

クロラムフェ二コール　12μl

方法

↓クリーンベンチにて昨日のプレートにマジックでコロニーに6つ印を入れる

↓スクリュービン一本に液体培地2ml、クロラムフェ二コール2μl加えたものを6本作る

↓火であぶったつまようじで先ほど印をつけたコロニーをつつきスクリュービンに入れるこれを6本分行う

↓その後37℃で一晩振とう培養する

結果

6本とも無事培養に成功し、コンタミも無かった

8/31

培養した菌液のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理

材料

昨日の大腸菌が増えた菌液を取り出し1.5mlチューブに1.4ml程度入れる。その後15000pm,5min,4℃で遠心

上澄みを廃棄しglucose solution(sol1)を100μｌ加えてvoltex

沈殿物を溶かした後0.2NNaCl1%SDS200μｌ加えてよく混ぜる

その後氷上5分

氷冷した3Mの酢酸カリウムをいれて氷上五分

15000rpm10min4℃で遠心

上澄みを新しいチューブに移す　入れてvoltex

900μlの2‐プロパノールを加え混ぜて、二分待つ

15000rpm,4℃,10分で遠心し、上澄みを捨てる

１mlの70%エタノールを加え15000rpm,2分,4℃で遠心する

沈殿物を乾かす

9/1  ベクターのゲル抽出 GFP改良版のPCR

材料

1%アガロースゲル

1kbpマーカー

6×loading dye

方法

↓アガロース0.2g、20μlをまぜて1%アガロースゲルを作る

↓制限酵素処理したベクターを50μlと6×loading dyeを6μl混ぜたものと1kbpのマーカーをゲルのコームに入れる

↓50V、60分電気泳動する

↓ゲルをEtBrで15分染色する

↓ゲルを紫外線に当てバンドのギリギリのところでカットする

↓それを1.5mlチューブに入れる

↓重さを量りそれの三倍量のBuffer QZを入れる

↓50度で10分溶かす（時々Voltex）

↓ゲルと等量のイソプロパノールを加える

↓カラムに入れて10000rpmで一分遠心する

↓0.5mlのBuffer QZをくわえて10000rpmで一分遠心

↓Buffer PEを1mlくわえて10000rpmで一分遠心

↓再度10000rpmで遠心し水気をとる

↓MillQを25μl加えて10000rpmで一分遠心する

PCRの

9/2 GFPのフェノクロ処理　電気泳動、制限酵素処理

フェノクロ処理

前回泳動した残りサンプルを合わせて135μlにする

milliQ65μl加えて全量を200μlにする

フェノール/クロロホルムを等量入れる

しっかりvoltexして、15000rpm,5分,25℃で遠心する

水層を別のエッペンに入れる（下の層がフェノール層）

次にクロロホルムのみで同様におこない、水層を別のエッペンに移す

1/10等量の3M酢酸ナトリウムを加える

等量のイソプロパノールを加え、よく振る

12000rpm,20分25℃で遠心する

沈殿をとらないように上澄みだけ除く

70%エタノールを200μl加える

軽く混ぜた後12000rpm,10分,25℃で遠心

上澄みを除いた後乾燥させて長期保存ならTE、すぐに使うならmilliQ50μlに溶かす

制限酵素処理

先ほどのDNA溶液50μlと切りたい場所の制限酵素（今回はPst1,EcoR1）を1μl、Bufferを使用する制限酵素にあわせたものを6μl（今回は10×H Buffer）、milliQ2μlを混ぜたものを37℃でインキュベートする

9/3 GFPのゲル抽出

9/5 ベクターとGFPのライゲーションとトラフォ

9/6二回目のベクターとGFPのライゲーション

9/7MLFのPCRと制限酵素処理とベクターの植菌

9/8MLFの完成、ライゲーションの相談とベクターのアルカリミニプレッツ、フェノクロ処理、制限酵素処理

9/9GFPとベクターの濃度を上げる目的でのエタノール沈殿失敗

9/12一回目大腸菌の植え付け GFPのPCRとフェノクロ処理と制限酵素処理

9/13二回目大腸菌の植え付け　GFPのゲル電気泳動と抽出

9/14大腸菌のベクター入りをアルカリミニプレッツ、フェノクロ処理、制限酵素処理

9/15 大腸菌のベクターを電気泳動、ゲル抽出、二回目GFP＋ベクターのライゲーション