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From 2011.igem.org

8/29(月)

武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）

【実験操作】

～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～

↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

～制限酵素処理～

フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した

反応液調整（cDNA）

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x H Buffer　　　　5μl

  Xho 1               1μl

 

　　反応液調整（vector）

      pUAST-flag vector(500ng/μl)  10μl

      milliQ                       34μl

      10x H Buffer                 5μl

      Xho 1                        1μl

 

↓反応液調整後、37℃で20時間静置