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From 2011.igem.org

8/22
（目的）
iGEMからのGFPを増やすために大腸菌に形質転換する（トランスフォーメーション）

（方法）

トランスフォーメーション

↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

（結果） 翌日コロニーの生育を確認することができた

8/23
（目的）
GFP開始コドン抜きのPCRプライマー設計　提出用ベクターのプレカルチャー
（方法）
PCRのプライマー設計の条件
大腸菌のベクターにはEXSPの制限酵素で切れる場所がありEX DNA SPとなる
今回はまず制限酵素サイトの間に付けられる塩基数が決まっていてEが2~3、Xが2~3、でSは3、でPは何塩基でもつけてよい。
そしてGFPにつなげる上で15塩基必要なのでその条件で設計した。
またプライマー設計においてもうリバースの方はアンチコドンで設計する必要がある。
そしてプライマー作成サイトでは温度が65度をなるべく超えないように注意した

プレカルチャー

昨日増やした提出用ベクターのコロニーを取りだした
そこにコロニーのふたにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじでコロニーを突っついた
LB液体培地2mlとクローラムフェニコール2μlを合わせた容器につまようじを入れた
これを6本分行った
一晩振とう培養をした

（結果）
翌日、菌液は十分に濁っていて増殖していたことが分かった
PCRのプライマーも設計し終わり2～3日で届くことになった


8/24

(目的）　　アルカリミニプレップ（プラスミド回収）電気泳動

（方法）

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する
電気泳動
↓6本のＤＮＡ溶液サンプル　5μlにmilliQ　0.3ml EcoR1　0.5μlPst1　0.5μl10×Buffer 0.7μlを 加え37℃30分インキュベート
↓１%agaゲル20μlより0.2gのagaを使いそこにTMNを20ml加えてゲルとする
↓電子レンジで沸騰させて粒がなくなった後ゲルが固まるまで待つ
↓1kbaseのマーカー5μlとDNAのLoading dye(×6)1μlとサンプル5μlとを足したもので計七個のサンプルをゲルの穴に注ぐ
↓電気泳動　100V 30分
↓EtBr染色(手袋をつけて)　10分
↓紫外線ランプを付けた元で撮影

（結果）
GFPは800bpの大きさなのであるべき場所にバンドが出て結果的には成功したといえた。
8/25
（目的）
LBプレートの作成　PCR フェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理

（方法）
LBプレート作成

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

PCR(GFP)

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cyle Anneling (60)°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

フェノクロ処理 ↓前回泳動した残りサンプルを合わせて135μlにした
↓milliQ65μl加えて全量を200μlにした
↓フェノール/クロロホルムを等量入れた
↓しっかりvoltexして、15000rpm,5分,25℃で遠心した
↓水層を別のエッペンに入れた（下の層がフェノール層）
↓次にクロロホルムのみで同様におこない、水層を別のエッペンに移した
↓1/10等量の3M酢酸ナトリウムを加えた
↓等量のイソプロパノールを加え、よく振った
↓12000rpm,20分25℃で遠心した
↓沈殿をとらないように上澄みだけ除いた
↓70%エタノールを200μl加えた
↓軽く混ぜた後12000rpm,10分,25℃で遠心
↓上澄みを除いた後乾燥させて長期保存ならTE、すぐに使うのでmilliQ50μlに溶かした

電気泳動
↓3本のＤＮＡ溶液サンプル　5μlにmilliQ　0.3ml EcoR1　0.5μlPst1　0.5μl10×Buffer 0.7μlを 加え37℃30分インキュベート
↓１%agaゲル20μlより0.2gのagaを使いそこにTMNを20ml加えてゲルとする
↓電子レンジで沸騰させて粒がなくなった後ゲルが固まるまで待つ
↓1kbaseのマーカー5μlとDNAのLoading dye(×6)1μlとサンプル5μlとを足したもので計七個のサンプルをゲルの穴に注ぐ
↓電気泳動　100V 30分
↓EtBr染色(手袋をつけて)　10分
↓紫外線ランプを付けた元で撮影

制限酵素処理

先ほどのDNA溶液50μlと切りたい場所の制限酵素（今回はPst1,EcoR1）を1μl、Bufferを使用する制限酵素にあわせたものを6μl（今回は10×H Buffer）、milliQ2μlを混ぜたものを37℃でインキュベートした 8/26
(目的)
大腸菌のベクターのトランス