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Team:KIT-Kyoto/yokoigawa
From 2011.igem.org
8/29(月)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）
【実験操作】
～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～
↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
～制限酵素処理～
フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した
反応液調整（cDNA）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector(500ng/μl) 10μl
milliQ 34μl
10x H Buffer 5μl
Xho 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
8/30(火)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)
【実験操作】
制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う
↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。
↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。
↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。
↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。
下記の反応液を調整する
反応液調整（DIAP2）
PCR産物 in milliQ 44μl
10x M Buffer 5μl
Xba 1 1μl
反応液調整（vector）
pUAST-flag vector in milliQ 44μl
10x H Buffer 5μl
Xba 1 1μl
↓反応液調整後、37℃で20時間静置
