Team:TzuChiU Formosa/Notebook/photopaper

2011.02.24
Discussion:

• Team organization
  
• Brain storming
  • paper made by bacteria with add-ons such as colors, fragrance, etc.
  • "light up" the plants for replacing lamp posts.

2011.03.04
Discussion:

• Team advisory
• Brain storming
  • Add-ons: colorful cellulose which produced by bacteria such as beta-carotene
  • information exchange with iGEM 2009 Cambridge team

2011.03.14
Discussion:

• Task Allocation
• Brain storming
  • Avatar - "light up" the plants by transfecting symbiotic bacteria which cloned into fluorescence gene
  • Eco-friendly warmer - biotic thermal pad

2011.03.23
Discussion:

• • Project : paperia
  • Option 1 : Culture bacteria which has pigment gene
  • Option 2 : Cellulose-producing bacteria secrete pigment into the medium

2011.03.24
Discussion:

• Exp. procedure:
  • cloning of cellulose gene’s CDS
  • the product should operate within E. coli.

2011.06.22
Discussion:

• Due to some unforseen reason, the team decided to change their project.
• New project: Biojenny

　　　　　　　　　-economical and humane way to produce paper in large quantities.
　　　　　　　　　-yeast to be our host

2011.07.01
Discussion:

• Freeze > grin > genome DNA isolation > Cloning = silk protein gene

2011.07.09
Discussion:

• the connections between 3 silk proteins : Fibl Fibh P25
• major proteins : H-chain, L-chain, P25

2011.07.15
Discussion:

• Due to limited resources and techniques required, the team decided to switch back to the previous project. Paper making !
• However it would be modified to be more innovative and creative.

2011.07.18
Discussion:

• Latest project : Photo paper
• cyanobacteria is designed as the host, cellulose made up of the glucose produced by cyanobacteria could be one of the main attraction of the project.

2011.07.23
Discussion:

• system modification to overcome the problems arises during preliminary round
• Biobricks from Tokyo 2010 team will be utilized
  • regulator promoter in order to regulate the secretion of cellulose to solve the aggregation of the bacteria

2011.09.15

Genome miniprep
Gluconacetobacter hansenii

2011.09.18

Gel/PCR DNA extraction
Gluconacetobacter hansenii

Protocols

2011.09.07

Rhodobacter rudrum medium

K2HPO4　　　　　　　　　　　 　 1g

NaCl　　　　　　　　　　　　 　 0.5g

FeSO4．7H2O　　　　　　　　 0.01g

CaCl2　　　　　　　　　　　　 0.02g

MnCl2．4H2O　　　　　　　　 0.002g

MgSO4．7H2O　　　　　　　　 0.2g

NaMO2O4．2H2O　　　　　　 0.01g

ddH2O　　　　　　　　　　　　　998.258ml

________________________________________
　　　　　　　　　　　　　　　　1L　→take100ml

　　　　　　　　　　＋　

Yeast Extrat　　　　　　　　　　　　　 0.5g

Sodium malate
(Sodium succinate dibasic hexohydrate)　 　5g

NH4Cl　　　　　　　　　　　　　　　 　 　1g

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　　　　 893.5ml

_________________________________________________
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　1L


Raise E. coli(PSB1C3)

1.50ml LB+500μl CHLORAMPHENICOL
2.37℃, overnight (14-16hrs)

2011.09.08-13

Plasmid miniprep kit

Raise Rhodobacter rubrum

1.50ml LB+500μl CHLORAMPHENICOL
2.37℃, overnight (14-16hrs)

2011.09.09

Raise Gluconacetobacter hansenii

1.50ml LB+500μl CHLORAMPHENICOL
2.37℃, overnight (14-16hrs)

2011.09.10-11

Digestion check of DNA

[pSB1C3/EcoRI]

DNA　　　　　　　　　　　 500ng

10×buffer　　　　　　　 5μl

BSA　　　　　　　　　　　 5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　 1μl

ddH2O　　　　　　　　　 29μl

_______________________________

total　　　　　　　　　　 50μl



[pSB1C3/PstⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　 500ng

10×buffer　　　　　　　　　　 5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　 5μl

pstⅠ　　　　　　　　　　　　 1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　 29μl

_________________________________

total　　　　　　　　　　　 50μl


Digestion of DNA

[pSB1C3/EcoRⅠ+PstⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　500ng

10×buffer　　　　　　　　　　 5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　 5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　　　 1μl

pstⅠ　　　　　　　　　　　　　 1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　28μl

__________________________________

total　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 30 mins


[pSB1C3/XbaⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　　　5μl

XbaⅠ　　　　　　　　　　　　　　 1μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　28μl

____________________________________

total 　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 2 hrs


[pSB1C3/SpeⅠ+PstⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　　　5μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　　　　1μl

pstⅠ　　　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　28μl

____________________________________

total 　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 2 hrs


[pSB1C3/EcoRⅠ+XbaⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　　　　　1μl

XbaⅠ　　　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　28μl

____________________________________

total 　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 2 hrs


[pSB1A3/EcoRⅠ+PstⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　　　　　1μl

PstⅠ　　　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　28μl

____________________________________

total 　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 2 hrs

[pSB1A3/EcoRⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　　　　　1μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　　28μl

____________________________________

total 　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 2 hrs

electroelution Purification

[pSB1C3/EcoRⅠ+PstⅠ]

[pSB1C3/XbaⅠ+SpeⅠ]

[pSB1C3/SpeⅠ+PstⅠ]

[pSB1C3/EcoRⅠ+XbaⅠ]

[pSB1A3/EcoRⅠ+PstⅠ]

[pSB1A3/EcoRⅠ+SpeⅠ]

2011.09.12-20

PCR

[acsAB]

[acsCD]

[cmcax-ccp]

template DNA　　　1μl

5×Buffer　　　　　4μl

2.5μM dNTP　　　　1.6μl

10μM F　　　　　　1μl

10μM R　　　　　　1μl

Taq　　　　　　　　0.2μl

ddH2O　　　　　　8.8μl

_______________________________

total　　　　　　　20μl



electroelution Purification

[acsAB]

[acsCD]

[cmcax-ccp]

2011.09.21

Digestion of DNA

[acsAB/ XbaⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　1μl

pstⅠ　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　28μl

____________________________

total　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr


[acsCD/XbaⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　5μl

XbaⅠ　　　　　　　　　　　　1μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　28μl

__________________________________
total　　　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr


[CMCax/SpeⅠ+AlwNⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　5μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　　1μl

AlwNⅠ　　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　28μl

__________________________________

total　　　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr


[Ccp/AlwNⅠ+PstⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　　　5μl

AlwNⅠ　　　　　　　　　　　　1μl

PstⅠ 　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　28μl

__________________________________
total　　　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr

2011.09.22

Ligation of DNA

Vector　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　 　2μl

ligase　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　-μl

________________________________

total　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr


[pSB1A3-acsCD]

Vector　　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　　　2μl

ligase　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　-μl

_________________________________

total　　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr


[pSB1C3-acsCD]

Vector　　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　　　2μl

ligase　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　-μl

_________________________________

total　　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr


[pSB1C3-CMCax-Ccp]

Vector　　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　　　2μl

ligase　　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　-μl

_________________________________

total　　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr

2011.09.23

PCR

R0011 promoter　　　　　　　 1μl

5×Buffer　　　　　　　　　　　　4μl

2.5μM dNTP　　　　　　　　　　1.6μl

Taq　　　　　　　　　　　　　　　0.2μl

ddH2O　　　　　　　　　　　　　13.2μl

_____________________________________

total　　　　　　　　　　　　　　20μl



Transformation of DNA

pSB1C3-acsAB

Transform into E.coli
LB+CHLORAMPHENICOL
→37℃ for 14 hr


pSB1C3-acsCD
Transform into E.coli
LB+CHLORAMPHENICOL
→37℃ for 14 hr

pSB1A3-acsCD
Transform into E.coli
LB+Ampicillin
→37℃ for 14 hr


pSB1C3-CMCax-Ccp
Transform into E.coli
LB+CHLORAMPHENICOL
→37℃ for 14 hr


Digestion of DNA

[R0011 promoter/EcoRⅠ+XbaⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　1μl

XbaⅠ　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　28μl

____________________________

total　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr

2011.09.24

Ligation of DNA

[pSB1C3-R0011]

Vector　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　 　2μl

ligase　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　-μl

________________________________

total　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr


[R0011-acsAB]

Vector　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　 　2μl

ligase　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　-μl

________________________________

total　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr

[R0011-acsCD]

Vector　　　　　　　　　　3μl

Insert　　　　　　　　　　14μl

ligase buffer　　　　　 　2μl

ligase　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　　-μl

________________________________

total　　　　　　　　　　20μl

→16℃ for 16 hr

2011.09.24

Digestion of DNA

[R0011-acsAB/EcoRⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　1μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　28μl

____________________________

total　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr

[R0011-acsCD/EcoRⅠ+SpeⅠ]

DNA　　　　　　　　　　　10μl

10×buffer　　　　　　　　5μl

BSA　　　　　　　　　　　5μl

EcoRⅠ　　　　　　　　　　1μl

SpeⅠ　　　　　　　　　　　1μl

ddH2O　　　　　　　　　　28μl

____________________________

total　　　　　　　　　　　　　50μl

→37℃ for 16 hr