Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

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9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min 40sec
End	4°C	keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62゜C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA Tm値
66.4゜C
増幅サイズ
　　約1514 bp

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。
9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。
9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解する
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加する
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。
9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min低速遠心した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min低速遠心した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。
松浪

【目的】
コンピテンシーの測定

【実験操作】

@@ Line 340: / Line 340: @@
 <br>
 【実験操作】<br>
-↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。
+↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。<br>
+月25日（日）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテントセルの作成<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<BR>
-↓OD<sob>600</sub>＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する<BR>
+SOB培地(1 L)
-↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
+<tr><td><table border=1 width="200px">
-↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
+<tr><td width="150px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>20 g</td></tr>
-↓氷上で10 min保冷する<BR>
+<tr><td align=center>bacto yeast extract</td><td align=right>5 g</td></tr>
-↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
+<tr><td align=center>5M NaCl</td><td align=right>2 mL</td></tr>
-↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
+<tr><td align=center>2K KCl</td><td align=right>1.25 mL</td></tr>
-↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する<BR>
+</table>
-↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む<BR>
-↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する<BR>
+<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
+<BR>
+Transformation Buffer(TB)
+<table border=1 width="150px">
+<tr><td width="100px" align=center>PIPES</td><td width="50px" align=right>1.5 g</td></tr>
+<tr><td align=center>CaCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.1 g</td></tr>
+<tr><td align=center>KCl</td><td align=right>9.3 g</td></tr>
+</table>
+<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解する<BR>
+↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる<BR>
+↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加する<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する<BR>
+<BR>
+↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
+月27日（火）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテントセルの作成<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
+↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
+↓氷上で10 min保冷した。<BR>
+↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
+↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
+↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。<BR>
+↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテンシーの測定<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<br>