Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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Revision as of 08:12, 30 September 2011

8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整する

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 μl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置する
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbpマーカー	5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector	50 µl
Lording Dyi	10 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cyle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	100sec
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた

9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH₂O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 μlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
DIAP2	50 ml
Lording Dyi	10 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土)
制限酵素処理
【目的】
PCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/18(日)
横井川
LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した

ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
DIAP2	50 ml
Lording Dyi	10 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/20（火）
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

ゲル抽出
【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
MLF	50 ml
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
濃度は70 ng/μlだった。

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

【結果】

9/21（水）
LBプレート作成

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製した
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

【結果】

9/22（木）
ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

9/23
ライゲーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション
【実験方法】

9/24
プレカルチャー
【目的】 pSB1C3の増殖
【実験方法】

9/25
濃度チェック
【目的】電気泳動によるGFPの濃度測定
【実験方法】

ライゲーション
【目的】 pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

9/26
ゲル抽出
【目的】 MLF,pSB1C3 vectorの精製
【実験方法】

ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 μl
MLF or pSB1C3 vector	50μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した

9/27

【目的】

【実験方法】

9/28
【目的】

【実験方法】

@@ Line 11: / Line 11: @@
 武田、横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<BR>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：<i>Xho</i> I）<br>
@@ Line 68: / Line 69: @@
 武田、横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：<i>Xho</i> I)<br>
@@ Line 115: / Line 117: @@
 /31(水)<BR>
 武田、横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
-制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<br>
+制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
 <BR>
 【実験操作】<BR>
@@ Line 166: / Line 169: @@
 /1(木)<BR>
 武田<BR>
-<BR>
+<br>
+PCR<BR>
 【目的】<br>
 DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
@@ Line 225: / Line 229: @@
 ↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
 ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+【結果】<br>
+正しい位置にバンドが確認できた
 <br>
@@ Line 232: / Line 237: @@
 /5(月)<BR>
 横井川<BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<BR>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
@@ Line 291: / Line 297: @@
 横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
@@ Line 335: / Line 342: @@
 /7(水)<BR>
 横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
 制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<BR>
@@ Line 367: / Line 375: @@
 /17（土)<BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
 PCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
@@ Line 411: / Line 420: @@
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
-制限酵素処理したPCR産物のゲル抽出<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製<BR>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 466: / Line 476: @@
 <br>
 <BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<br>
 MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製<br>
@@ Line 511: / Line 522: @@
 <br>
 <br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFのライゲーション産物の増殖<br>
@@ Line 523: / Line 535: @@
 ↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 ↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+【結果】<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 547: / Line 560: @@
 <br>
+ライゲーション<br>
 【目的】<br>
 pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
@@ Line 554: / Line 567: @@
 <br>【実験方法】<br>
 <br>
-<br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFのライゲーション産物の増殖<br>
@@ Line 570: / Line 583: @@
 <br>
-<br>
+【結果】<br>
 <br>
 /22（木）<br>
+ライゲーション<br>
 【目的】<br>
 pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
@@ Line 579: / Line 593: @@
 【実験方法】<br>
 <br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<br>