Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

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(Created page with "<html> <body> 9月12日（月） <br> 松浪、横井川<br> <br> 【目的】<br> cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br> <br> 【実験操作】<font color=red>←ぷ...")
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cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
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-
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする！！</font><br>
+
【実験操作】<br>
-
　（1）PCR反応液の調製<br>
+
＊プライマーの塩基配列<br>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
・DIAP2<br>
-
&lt;1本分あたり&gt;<br>
+
F primer<br>
-
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　&nbsp;
+
        GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>   
-
1
+
Tm値<br>  
-
&micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x
+
　　　  62 ゜C<br>
-
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
R primer<br>
-
2 &micro;L　　　　　　<br>
+
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
-
  &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
Tm値<BR>      
-
dNTP(2.0
+
        66.4゜C<br>
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
+
増幅サイズ　　約1514 bp<br>
-
primer(10
+
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
1.5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
R primer(10
+
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
1.5
+
-
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
Templet
+
-
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
1 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;33
+
-
&micro;L<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
上記の分量を混合した。<br>
+
-
　　　<br>
+
-
　　　＊&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
+
-
　　　　　・DIAP2<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
F
+
-
primer&nbsp;&nbsp;:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
Tm値<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃<br>
+
-
　　　　　　 R primer&nbsp;
+
-
:<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
66.4 ℃<br>
+
-
　　　　　　増幅サイズ　　約1514
+
-
bp<br>
+
<br>
<br>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border="0"><tr><td>
-
　　　&nbsp;<br>
+
<table border="0" width="150px">
-
&nbsp;<br>
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
　 (2)PCR反応条件<br>
+
</table>
-
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94
+
<table border=1 width="220px">
-
℃　　　2 min<br>
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
-
<br>
+
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-
&lt;2&gt;×35　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
+
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-
15
+
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-
sec<br>
+
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
-
Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
+
<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-
sec<br>
+
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</table>
-
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
+
</td><TD></TD><TD></TD><td>
-
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 min 40
+
<table border="0" width="100px">
-
sec<br>
+
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
-
<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&lt;3&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border=1 width="400px">
-
　4℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
∞<br>
+
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
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上記の条件でPCRを行った。<br>
上記の条件でPCRを行った。<br>
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Revision as of 06:28, 30 September 2011

9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。 　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　 
 
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した。
9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。













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