Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

From 2011.igem.org

(Difference between revisions)
Line 32: Line 32:
<br>
<br>
<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
-
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する<br>
+
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
Line 58: Line 58:
</table>
</table>
37°Cで20時間静置した
37°Cで20時間静置した
-
<br></p>
+
<br>
-
</body>
+
Line 66: Line 65:
-
<head>
+
8/30(火)<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
武田、横井川<BR>
-
<title></title>
+
<BR>
-
</head>
+
【目的】<br>
-
<body>
+
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:<i>Xho</i> I)<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">8/30(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">)<o:p></o:P></span></p>
+
【実験操作】<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田、横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br>
+
↓PCR産物を400 &micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">の制限酵素処理</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">二回目:</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">Xba I)<br>
+
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br>
+
-
<strong>PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
+
-
</strong>↓PCR産物を400  
+
-
&micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
+
-
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400  
+
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
Line 86: Line 79:
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
-
↓3M  
+
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
-
CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100%  
+
-
ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
+
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
-
↓上澄みを捨て、70%  
+
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 &micro;l加える<br>
-
ethanol(EtOH)を200  
+
-
&micro;l加える<br>
+
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
-
↓ddH<sub>2</sub>Oを44  
+
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
<br>
<br>
-
<strong>制限酵素処理(Xba  
+
<strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
-
I)</strong></span></span></p><br>
+
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
Line 124: Line 111:
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する <br>
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する <br>
-
</body>
 
-
<head>
+
8/31(水)<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
武田、横井川<BR>
-
<title></title>
+
【目的】<BR>
-
</head>
+
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<br>
-
<body>
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">8/31(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">)<o:p></o:P></span></p>
+
【実験操作】<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田、横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
ゲルからのDNA抽出<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">制限酵素処理した</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物・</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">のゲル抽出<br>
+
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】</span></p>
+
-
<p><strong>ゲルからのDNA抽出<br>
+
-
</strong>
+
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
Line 173: Line 154:
↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする<br>
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする<br>
-
</p>
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【結果】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><?xml:namespace prefix ="" o ns =""
+
<BR>
-
"urn:schemas-microsoft-com:office:office" /><o:p></o:p></span></p>
+
【結果】<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">は精製でき、濃度は</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">45.0375ng/</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">μ</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">l</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">であった。</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:p></span></p>
+
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">DIAP2</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">はゲル抽出でバンドが見られなかった。</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:p></span></p>
+
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。<BR>
-
<p>
+
-
<br></p>
+
-
</body>
+
<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
-
<head>
+
9/1(木)<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
武田<BR>
-
<title></title>
+
<BR>
-
</head>
+
【目的】<br>
-
<body>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">9/1(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">)<o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br>
+
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
-
</p>
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br>
+
【実験操作】<br>
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p>下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
+
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
-
右に示したプログラムで反応を行う<br></o:P></span></p></span>
+
右に示したプログラムで反応を行う<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0" width="150">
<table border="0" width="150">
Line 222: Line 199:
<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
-
</table></td></tr></tbody></table><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【目的】<span lang="EN"><br>
+
</table></td></tr></tbody></table>
-
</span> <span lang="EN">PCR</span>産物の確認<br>
+
 
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br>
+
<BR>
-
</span></span>
+
<BR>
-
<p><strong>ゲル電気泳動</strong></p>
+
【目的】<BR>
 +
PCR産物の確認<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
<strong>ゲル電気泳動</strong></p><BR>
Line 247: Line 228:
<br>
<br>
-
</body>
+
<BR>
-
 
+
<BR>
-
<head>
+
9/5(月)<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
横井川<BR>
-
<title></title>
+
【目的】<BR>
-
</head>
+
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho I)<br>
-
<body><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">9/5(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">)</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
【実験操作】<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
↓PCR産物を400 &micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">の制限酵素処理(一回目:</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">Xho I</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">)<br>
+
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
</p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br>
+
-
</span></span><strong>PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
+
-
</strong>↓PCR産物を400  
+
-
&micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
+
-
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400  
+
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
Line 270: Line 244:
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
-
↓3M  
+
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
-
CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100%  
+
-
ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
+
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
-
↓上澄みを捨て、70%  
+
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 &micro;l加える<br>
-
ethanol(EtOH)を200  
+
-
&micro;l加える<br>
+
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
-
↓ddH<sub>2</sub>Oを44  
+
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
 +
<br>
<br>
-
</p>
+
<BR>
-
<p><strong>制限酵素処理(<i>Xho</i>  
+
 
-
I)</strong><br>
+
制限酵素処理(<i>Xho</i> I)<br>
-
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する<br>
+
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
Line 318: Line 288:
</body>
</body>
-
<head>
+
9/6(火)<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
横井川<BR>
-
<title></title>
+
<BR>
-
</head>
+
【目的】<br>
-
<body><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">
+
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:Xba I)<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">9/6(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">)</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
【実験操作】<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br>
+
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">の制限酵素処理</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">二回目:</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">Xba I)<br>
+
</strong>↓PCR産物を400 &micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br>
+
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
<strong>PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
+
-
</strong>↓PCR産物を400  
+
-
&micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
+
-
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400  
+
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
Line 338: Line 303:
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
-
↓3M  
+
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
-
CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100%  
+
-
ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する<br>
+
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
-
↓上澄みを捨て、70%  
+
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 &micro;l加える<br>
-
ethanol(EtOH)を200  
+
-
&micro;l加える<br>
+
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
-
↓ddH<sub>2</sub>Oを44  
+
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 &micro;l加えてvoltexする<br>
-
&micro;l加えてvoltexする<br>
+
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
 +
<br>
<br>
-
<strong>制限酵素処理(Xba  
+
<BR>
-
I)</strong></span></span></p>
+
 
-
<br>
+
制限酵素処理(Xba I)<br>
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
Line 371: Line 332:
<br>
<br>
-
</body>
+
<BR>
-
 
+
9/7(水)<BR>
-
<head>
+
横井川<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
【目的】<BR>
-
<title></title>
+
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<BR>
-
</head>
+
<BR>
-
<body>
+
【実験操作】<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">9/7(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt"></span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">)</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
ゲルからのDNA抽出<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt">横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">制限酵素処理した</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物・</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">のゲル抽出</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br>
+
-
</span></p>
+
-
<p><strong>ゲルからのDNA抽出<br>
+
-
</strong>
+
-
 
+
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<br>
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<br>
Line 401: Line 355:
↓50 Vで60分間電気泳動する<br>
↓50 Vで60分間電気泳動する<br>
↓EtBrでゲルを10分間染色する<br>
↓EtBrでゲルを10分間染色する<br>
-
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br></p>
+
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; TEXT-INDENT: -12pt; MARGIN: 0mm 0mm 0pt 12pt; mso-pagination: widow-orphan; mso-char-indent-count: -1.0" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【結果】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; TEXT-INDENT: -12pt; MARGIN: 0mm 0mm 0pt 12pt; mso-pagination: widow-orphan; mso-char-indent-count: -1.0" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p></p>
+
-
</body>
+
<BR>
 +
<BR>
 +
【結果】<BR>
 +
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
-
<head>
+
<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
<BR>
-
<title></title>
+
<BR>
-
</head>
+
-
<body>
+
-
<p>9/17(土)<br>
+
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br>
+
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">産物</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">の制限酵素処理</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">(</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">二回目:</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">Xba I)<br>
+
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br>
+
-
</span></span>
+
9/17(土)<BR>
-
<strong>制限酵素処理(Xba  
+
【目的】<br>
-
I)</strong><br>
+
PCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
制限酵素処理(Xba I)<br>
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
下記の組成に従って反応液を調整する<br>
Line 435: Line 386:
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する  
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する  
<br>
<br>
 +
<BR>
-
</p>
+
9/18(日)<BR>
-
</body>
+
横井川<BR>
-
<head>
+
LB培地<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
-
<title></title>
+
-
</head>
+
-
<body>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">9/18(日</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-bidi-font-size: 10.5pt" lang="EN-US">)</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt">横井川&nbsp;
+
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-size: 10.5pt">&nbsp;<br>
+
-
</span><strong>LB培地</strong>
+
-
</p>
+
<tr><td><table border="1" width="200">
<tr><td><table border="1" width="200">
Line 468: Line 411:
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
【目的】<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">制限酵素処理した</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">のゲル抽出</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+
制限酵素処理したPCR産物のゲル抽出<BR>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br>
+
<BR>
-
</span></p>
+
【実験操作】<br>
-
<p><strong>ゲルからのDNA抽出<br>
+
ゲルからのDNA抽出<br>
-
</strong>
+
<BR>
-
 
+
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<br>
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<br>
Line 490: Line 432:
↓EtBrでゲルを10分間染色する<br>
↓EtBrでゲルを10分間染色する<br>
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br></p>
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br></p>
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; TEXT-INDENT: -12pt; MARGIN: 0mm 0mm 0pt 12pt; mso-pagination: widow-orphan; mso-char-indent-count: -1.0" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【結果】</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
 
-
<p style="TEXT-ALIGN: left; TEXT-INDENT: -12pt; MARGIN: 0mm 0mm 0pt 12pt; mso-pagination: widow-orphan; mso-char-indent-count: -1.0" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'MS 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS Pゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'MS Pゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
 
-
<p></p>
 
-
</body>
+
<BR>
-
<head>
+
<BR>
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
【結果】<BR>
-
<title></title>
+
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
-
</head>
+
-
<body>
+
-
<p>9/20(火)<br>
+
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【目的】<span lang="EN"><br>
+
-
</span> DIAP2の<span lang="EN">PCR</span>産物の確認<br>
+
-
</span><span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】</span><br><strong>ゲル電気泳動</strong></p>
+
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
9/20(火)<br>
 +
【目的】<BR>
 +
DIAP2のPCR産物の確認<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<BR>
 +
ゲル電気泳動<BR>
 +
<BR>
ゲル1枚当たりの組成
ゲル1枚当たりの組成
Line 522: Line 465:
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br>
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br>
<br>
<br>
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【目的】<span lang="EN"><br>
+
<BR>
-
</span></span>MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。<br>
+
【目的】<br>
 +
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。<br>
 +
<BR>
【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
-
<strong>ゲルからのDNA抽出<br>
+
ゲルからのDNA抽出<br>
-
</strong>
+
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
Line 562: Line 506:
↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする<br>
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする<br>
 +
<BR>
【結果】<br>
【結果】<br>
-
濃度は70  
+
濃度は70 ng/&micro;lだった。<br>
-
ng/&micro;lだった。<br>
+
<br>
<br>
<br>
<br>
-
<span style="FONT-FAMILY: 'MS 明朝','serif'; COLOR: black; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: Arial; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-theme-font: minor-fareast; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-fareast; mso-bidi-font-size: 10.5pt; mso-ansi-language: EN; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【目的】<span lang="EN"><br>
+
【目的】<br>
-
</span></span>MLFのライゲーション産物の増殖<br>
+
MLFのライゲーション産物の増殖<br>
-
【実験方法】<br>トランスフォーメーション<br>↓氷上でコンピテント細胞(DH5  
+
【実験方法】<br>
-
Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30  
+
トランスフォーメーション<br>
-
&micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>↓90
+
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
-
&micro;lのSOC培地を加えた<br>↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br><br><br>
+
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 &micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓90 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
-
<br>
+
<br>
 +
<br>
 +
<br>
-
<br><br>
+
9/21(水)<br>
-
 
+
LBプレート作成<BR>
-
</body>
+
-
 
+
-
<head>
+
-
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
-
<title></title>
+
-
</head>
+
-
<body>
+
-
<p>9/21(水)<br>
+
-
<strong>LBプレート作成</strong>
+
</p><table border="1" width="170">
</p><table border="1" width="170">
<tr><td width="100" align="center">LB培地</td><td width="70" align="right">&nbsp;</td></tr>
<tr><td width="100" align="center">LB培地</td><td width="70" align="right">&nbsp;</td></tr>
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【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
トランスフォーメーション<br>
トランスフォーメーション<br>
-
↓氷上でコンピテント細胞(DH5  
+
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
-
Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 &micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>
-
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30  
+
-
&micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>
+
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
-
↓DNAをチューブに3  
+
↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
-
&micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
-
↓60  
+
↓60 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
-
&micro;lのSOC培地を加えた<br>
+
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
-
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-
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 +
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 +
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 +
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</body>
+
9/22(木)<br>
-
 
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<head>
+
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<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+
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<title></title>
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+
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<p>9/22(木)<br>
+
【目的】<br>
【目的】<br>
-
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3  
+
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
-
vectorとGFPのライゲーション<br>
+
<br>
<br>
【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
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【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
トランスフォーメーション<br>
トランスフォーメーション<br>
-
↓氷上でコンピテント細胞(DH5  
+
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
-
Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 &micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>
-
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30  
+
-
&micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>
+
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
-
↓DNAをチューブに3  
+
↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
-
&micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
-
↓60  
+
↓60 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
-
&micro;lのSOC培地を加えた<br>
+
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>

Revision as of 04:52, 26 September 2011

8/29(月)

武田、横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xba I)


下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する
8/31(水)
武田、横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbpマーカー5 ml
DIAP2 or PUAST-flag vector50 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 μlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする


【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。



9/1(木)
武田

【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
PCR条件
10 μM Primer F1.5 μl
10 μM Primer R1.5 μl
Template DNA1 μl
10 x PCR Buffer5 μl
dNTPs5 μl
MgSO42 μl or 4 μl
ddH2O33 μl or 31 μl
KOD+ polymelase1 μl
 total 50 μl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C100sec
End4°Ckeep 


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動


ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する



9/5(月)
横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する


制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整する
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/6(火)
横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する


制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/7(水)
横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
DIAP250 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する


【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。



9/17(土)
【目的】
PCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/18(日)
横井川
LB培地
bacto tryptone10 g
bacto yeast evtract5 g
NaCl10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する



【目的】
制限酵素処理したPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
DIAP250 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する



【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。



9/20(火)
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する


【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
MLF50 ml
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 μlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする

【結果】
濃度は70 ng/µlだった。


【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。



9/21(水)
LBプレート作成

LB培地 
bacto-agar15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20~25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】


【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。



9/22(木)
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。