Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

From 2011.igem.org

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↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める<br>
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↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する<br>
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</span></span>MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。<br>
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【実験方法】<br>
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<strong>ゲルからのDNA抽出<br>
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↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<br>
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↓50 Vで60分間電気泳動する<br>
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↓EtBrでゲルを40分間染色する<br>
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↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br>
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↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす<br>
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↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る<br>
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↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える<br>
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↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす<br>
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↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する<br>
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↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる<br>
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↓カラムにサンプルをのせる<br>
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↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる<br>
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↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす<br>
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↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる<br>
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↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
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↓37 μlのMilliQを加える<br>
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↓10,000 rpmで1分間遠心する<br>
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↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする<br>
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【結果】<br>
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濃度は70
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ng/&micro;lだった。<br>
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</span></span>MLFのライゲーション産物の増殖<br>
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【実験方法】<br>トランスフォーメーション<br>↓氷上でコンピテント細胞(DH5
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Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30
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&micro;lのコンピテント細胞を分注した<br>↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>↓90
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&micro;lのSOC培地を加えた<br>↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br><br><br>
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Revision as of 11:46, 25 September 2011

8/29(月)

武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する

cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
XhoⅠ1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
XhoⅠ1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

8/30(火)

武田、横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xba I)


下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
XbaⅠ1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
XhoⅠ1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

8/31(水)

武田、横井川

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】

ゲルからのDNA抽出
 QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbpマーカー5 ml
DIAP2 or PUAST-flag vector50 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 μlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする

【結果】

pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375ng/μlであった。

DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。


9/1(木)

武田

【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う

PCR条件
10 μM Primer F1.5 μl
10 μM Primer R1.5 μl
Template DNA1 μl
10 x PCR Buffer5 μl
dNTPs5 μl
MgSO42 μl or 4 μl
ddH2O33 μl or 31 μl
KOD+ polymelase1 μl
 total 50 μl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C100sec
End4°Ckeep 
【目的】
　PCR産物の確認
【実験操作】

ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

9/5(月)

横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する

cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
XhoⅠ1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
XhoⅠ1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/6(火)

横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xba I)


下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
XbaⅠ1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/7(水)

横井川

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】

ゲルからのDNA抽出
 QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbp or 100bp マーカー3 ml
DIAP250 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

【結果】

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
 制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整する

DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
XbaⅠ1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する

9/18(日)

横井川   
LB培地

bacto tryptone10 g
bacto yeast evtract5 g
NaCl10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する



【目的】

制限酵素処理したPCR産物のゲル抽出

【実験操作】

ゲルからのDNA抽出
 QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbp or 100bp マーカー3 ml
DIAP250 ml
Lording Dyi10 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

【結果】

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/20（火）
【目的】
　DIAP2のPCR産物の確認
【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。
【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
 QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
MLF50 ml
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 μlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする
【結果】
濃度は70 ng/µlだった。


【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。





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