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Team:KIT-Kyoto/yokoigawa
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| + | <p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田、横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p> | ||
| + | <p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p> | ||
| + | <p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">の制限酵素処理（一回目：</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">Xho I</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">）<br> | ||
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| + | <p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br> | ||
| + | </span></span><strong>PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br> | ||
| + | </strong>↓PCR産物を400 | ||
| + | µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br> | ||
| + | ↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 | ||
| + | µl加えてvoltexする<br> | ||
| + | ↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br> | ||
| + | ↓水層のみを新しいチューブに移す<br> | ||
| + | ↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする<br> | ||
| + | ↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br> | ||
| + | ↓水層のみを新しいチューブに移す<br> | ||
| + | ↓3M | ||
| + | CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% | ||
| + | ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する<br> | ||
| + | ↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br> | ||
| + | ↓上澄みを捨て、70% | ||
| + | ethanol(EtOH)を200 | ||
| + | µl加える<br> | ||
| + | ↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br> | ||
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| + | µl加えてvoltexする<br> | ||
| + | ※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br> | ||
| + | <br> | ||
| + | </p> | ||
| + | <p><strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> | ||
| + | I)</strong><br> | ||
| + | 下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する<br> | ||
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| + | <tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td> </td><td align="right">total 50 μl</td></tr> | ||
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| + | <tr><td>vector</td></tr> | ||
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| + | <table border="1" width="250"> | ||
| + | <tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/μl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td> </td><td align="right">total 50 μl</td></tr> | ||
| + | </table> | ||
| + | </td></tr> | ||
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| + | 37°Cで20時間静置する | ||
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Revision as of 11:19, 25 September 2011
8/29(月)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400
µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M
CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70%
ethanol(EtOH)を200
µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44
µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xho
I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する
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