Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）

【実験操作】

～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～

↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

～制限酵素処理～

フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した

反応液調整（cDNA）

  PCR産物 in milliQ   44μl

  10x H Buffer　　　　5μl

  Xho 1                             1μl

　　反応液調整（vector）

      pUAST-flag vector(500ng/μl)  10μl

      milliQ                                             34μl

      10x H Buffer                                   5μl

      Xho 1                                                1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

8/30(火)

武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)

【実験操作】

制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う

↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

下記の反応液を調整する

反応液調整（DIAP2）

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x M Buffer              5μl

  Xba 1                            1μl

反応液調整（vector）

  pUAST-flag vector in milliQ  44μl

  10x H Buffer                                5μl

  Xba 1                                             1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

8/31(水)

武田、横井川

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】

～反応液の電気泳動～

SeaKem^RGTG^Rのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。

↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）

↓50V60minで電気泳動した。

↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。

↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。

↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVを点灯させてナイフで切り出した。

↓ゲルの重さを測定

～DNA精製（QIAquick Gel Extraction kitを使用）～

ゲルの重さに対して三倍量のBufferQGを加え、50℃のウォーターバスでincubate(約10min)。

↓isopropanolをゲルの重さと等量加えて混ぜた。

↓精製カラムに溶液をセットし遠心した。下段に排出された溶液は廃棄。

↓BufferQG500μlをカラムにセットし遠心した。下段に排出された溶液は
  廃棄。

↓BufferPE750μlをカラムにセットし遠心した。下段に排出された溶液は
  廃棄。

↓カラム本体を新しいチューブにセット、milliQ37μlを加えて遠心した。

↓ 下段の新しいチューブに精製されたDNA in milliQ約35μlができた。

～DNA濃度の測定～

milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。

【結果】

pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375ng/μlであった。

DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)

武田

【目的】

cDNA vectorを鋳型としたDIAP2の増殖

（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　KOD+ polymelase 　      1 µL
       10 x Buffer　                         2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                        5 µL
       F primer(10 µM)                 1.5 µL
       R primer(10 µM)                 1.5 µL      
       Templet DNA                         1 µL
       milliQ                                     33 µL

上記の分量を混合した。

(2)PCR反応条件
　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min
        <2>×35　 　Denature        　 94 ℃　　    15 sec
                                Annealing         50.5 ℃　　   30 sec
                                Extension          68 ℃                1 min 40 sec
        <3>                                  　4℃        ∞
        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認
【実験操作】
  PCR反応液　　　       2 µL
  milliQ                8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動し

た。泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

9/5(月)

横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）

【実験操作】

～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～

↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で
  遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ
    中にDNAを溶解させる。

～制限酵素処理～

フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した

反応液調整（cDNA）

  PCR産物 in milliQ   44μl

  10x H Buffer　　　　5μl

         Xho 1                             1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

9/6(火)

横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)

【実験操作】

制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う

↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で
  遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

下記の反応液を調整する

反応液調整（DIAP2）

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x M Buffer              5μl

  Xba 1                            1μl

反応液調整（vector）

  pUAST-flag vector in milliQ  44μl

  10x H Buffer                                5μl

  Xba 1                                             1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

9/7(水)

横井川

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】

～反応液の電気泳動～

SeaKem^RGTG^Rのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。

↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）

↓50V60minで電気泳動した。

↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。

↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。

↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。

【結果】

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/13(火)

松浪、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho 1）

【実験操作】

～フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿～

↓DAIP2のPCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

～制限酵素処理～

フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した

反応液調整（cDNA）

  PCR産物 in milliQ   44μl

  10x H Buffer　　　　5μl

  Xho 1                             1μl

　　反応液調整（vector）

      pUAST-flag vector(500ng/μl)  10μl

      milliQ                                             34μl

      10x H Buffer                                   5μl

      Xho 1                                                1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

9/14(水)

松浪、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)

【実験操作】

制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う

↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

下記の反応液を調整する

反応液調整（DIAP2）

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x M Buffer              5μl

  Xba 1                            1μl

反応液調整（vector）

  pUAST-flag vector in milliQ  44μl

  10x H Buffer                                5μl

  Xba 1                                             1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

9/15(木)

松浪、横井川

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】

～反応液の電気泳動～

SeaKem^RGTG^Rのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。

↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）

↓50V60minで電気泳動した。

↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。

↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。

↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。

【結果】

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17(土)

横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xbal)

【実験操作】

下記の反応液を調整する

反応液調整（DIAP2）

  PCR産物 in TE       44μl

  10x M Buffer             5μl

  Xba 1                           1μl

↓反応液調整後、37℃で20時間静置

9/18(日)

横井川

【目的】

LB培地づくり

【実験操作】

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる

↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす

↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして

↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

【目的】

制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出

【実験操作】

制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う

↓PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex し10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltexし10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH₃COONa(PH 5.27)を1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

↓3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70％ethanolを200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

～反応液の電気泳動～

SeaKem^RGTG^Rのアガロースを使用して1％ゲルを作成した。

↓制限酵素処理した反応液50μlに対して6x loading dyeを10μlを加えて混ぜ、アガロースゲルのコーム穴に入れた。（DNAマーカーも同様に入れる）

↓50V60minで電気泳動した。

↓電気泳動後、EtBrでゲルを染色した。

↓染色後、milliQでゲルを数回洗った。

↓UVイルミネーター上にゲルを置いたプレートをセットし、UVランプを当ててバンドを確認した。

【結果】