Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

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9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 °C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。

9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 °C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 °C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。

9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min 40sec
End	4°C	keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62°C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ
　　約1514 bp

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

API2-MALT1

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x L Buffer	5 µl
Nhe Ⅰ	1 µl
	total 50 µl

9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。

DIAP2	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。

9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル（DH5α）の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。

9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

9月22日（木）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

9月23日（金）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。

DIAP2	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。

9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル(DH5α)の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。

9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10³ g)した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min遠心(5 x 10³ g)した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。

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 【実験操作】<br>
 ↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
-↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
 ↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
 ↓氷上で10 min保冷した。<BR>
-↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+↓4°Cで10min遠心(5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
 ↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
 ↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>