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	EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>		EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
		+	<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/6/68/2011.08.23_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
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Revision as of 15:46, 2 October 2011

8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 56.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値　57.8゜C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5゜C
増幅サイズ　　約3131 bp


8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。

8月10日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 1kb/min +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 56.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。

8月11日（木）

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH₂O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH₂O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1

0.189

0.208

0.192

0.190

0.191

平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5

0.282

0.276

0.278

0.269

0.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 58.9°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月16日（火）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 58.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




8月17日（水）

松浪、横井川


【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


８/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 68°C 3min20sec End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




8月24日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月25日（木）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

・DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH2O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。