Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

From 2011.igem.org

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<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
</table>
</table>
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<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
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<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
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【実験方法】<br>
【実験方法】<br>
以下の条件でPCRを行った。<BR>
以下の条件でPCRを行った。<BR>
 +
・API2-MALT1<br>
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<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
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<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
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<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
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<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
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<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
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</td></tr>
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・DIAP2<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0" width="150px">
<table border="0" width="150px">
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上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
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Revision as of 15:54, 2 October 2011

9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62゜C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した。


9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
API2-MALT1
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x L Buffer5 µl
Nhe Ⅰ1 µl
 total 50 µl


9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。




9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl


9月22日（木）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl


9月23日（金）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min低速遠心した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min低速遠心した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。


9月28日（水）
松浪

【目的】
コンピテンシーの測定

【実験操作】


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