Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

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9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 ゜C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min 40sec
End	4°C	keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62゜C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA Tm値
66.4゜C
増幅サイズ
　　約1514 bp

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

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@@ Line 72: / Line 72: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f4/2011.09.13_DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
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