Team:KIT-Kyoto/nakagawa

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Revision as of 14:20, 18 September 2011

8/22
（目的）
iGEMからのGFPを増やすために大腸菌に形質転換する（トランスフォーメーション）

（方法）

トランスフォーメーション

↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

（結果）翌日コロニーの生育を確認することができた

8/23
（目的）
GFP開始コドン抜きのPCRプライマー設計　提出用ベクターのプレカルチャー
（方法）
PCRのプライマー設計の条件
大腸菌のベクターにはEXSPの制限酵素で切れる場所がありEX DNA SPとなる
今回はまず制限酵素サイトの間に付けられる塩基数が決まっていてEが2~3、Xが2~3、でSは3、でPは何塩基でもつけてよい。
そしてGFPにつなげる上で15塩基必要なのでその条件で設計した。
またプライマー設計においてもうリバースの方はアンチコドンで設計する必要がある。
そしてプライマー作成サイトでは温度が65度をなるべく超えないように注意した

プレカルチャー

昨日増やした提出用ベクターのコロニーを取りだした
そこにコロニーのふたにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじでコロニーを突っついた
LB液体培地2mlとクローラムフェニコール2μlを合わせた容器につまようじを入れた
これを6本分行った
一晩振とう培養をした

（結果）
翌日、菌液は十分に濁っていて増殖していたことが分かった
PCRのプライマーも設計し終わり2～3日で届くことになった

8/24

(目的）　　

アルカリミニプレップ

（プラスミド回収）
（方法）

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

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 <BR>
 <BR>
-/24<BR>
+/24<BR><BR>
-アルカリミニプレッツ（プラスミド回収）
+(目的）　　<p><strong>アルカリミニプレップ</strong></p>（プラスミド回収）
+<BR>
+（方法）<BR>
+<tr><td><table border=1 width="280px">
+<tr><td width="80px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
+<tr><td align=center>Solution II</td><td align=right>0.2 N NaOH</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1% SDS</td></tr>
+<tr><td align=center>Solution III</td><td align=right>3 M 酢酸カリウム</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1.8 M 酢酸</td></tr>
+</table>
 </body>
 </html>