Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

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Revision as of 07:58, 18 September 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

LBプレート

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

トランスフォーメーション

去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する

今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する

アルカリミニプレップ

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす

今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する

ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
★DNAサンプル入力	★入力
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

テーブルタグ

テーブルタグ2

れお、中川くんのやつ下記の組成に従って試薬をまぜる右に示したプログラムで反応を行う

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
鋳型 DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	全量 50 µl

Start	95°C、30秒
Cycle x 30	95°C、30秒(熱変性)
	(Tm-5)°C、1分(アニーリング)
	68°C、1kb/分(伸長)
End	4°Cで保持

@@ Line 25: / Line 25: @@
 ↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす<BR>
 ↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして<BR>
-↓121 ℃で20分オートクレーブ滅菌する<BR>
+↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
@@ Line 42: / Line 42: @@
 ↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する<BR>
 ↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する<BR>
-↓65 C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える<BR>
+↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える<BR>
 ↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する<BR>
 ↓水平な所に置いて固まらせる<BR>
@@ Line 60: / Line 60: @@
 ↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する<BR>
 ↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する<BR>
-↓余ったコンピテント細胞は-80 Cの冷凍庫に戻す<BR>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す<BR>
 ↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす<BR>
-↓42 Cで45秒間熱ショックを与える<BR>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与える<BR>
 ↓0.9 mlのSOC培地を加える<BR>
-↓37 Cで1時間、振りながら回復培養する<BR>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する<BR>
 ↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく<BR>
-↓37 Cで一晩培養する<BR>
+↓37°Cで一晩培養する<BR>
 <BR><BR>
@@ Line 76: / Line 76: @@
 ↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える<BR>
 ↓氷上で15分間冷やす<BR>
-↓43 Cで30秒間熱ショクを与える<BR>
+↓43°Cで30秒間熱ショクを与える<BR>
 ↓氷上で10分間冷やす<BR>
-↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37 C(API2-MALT1は30 C)で30分間回復培養する<BR>
+↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する<BR>
 ↓LB(+amp)プレートに塗る<BR>
-↓37 C(API2-MALT1は30 C)で培養する<BR>
+↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する<BR>
@@ Line 88: / Line 88: @@
 <p><strong>アルカリミニプレップ</strong></p>
-<tr><td><table border=1 width="300px">
+<tr><td><table border=1 width="280px">
-<tr><td width="100px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
+<tr><td width="80px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
@@ Line 102: / Line 102: @@
 <BR>
-↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37 Cで一晩培養する<BR>
+↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する<BR>
 ↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-↓2 mlのLB培地で37 Cで一晩振とう培養する<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する<BR>
 ↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす<BR>
-↓15,000 rpm、4 Cで1分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる<BR>
 ↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する<BR>
 ↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
@@ Line 112: / Line 112: @@
 ↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
 ↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓15,000 rpm、4 Cで5分間遠心する<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する<BR>
 ↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる<BR>
 ↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
 ↓2分間室温で放置する<BR>
-↓15,000 rpm、4 Cで10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
 ↓1 mlの70%エタノールを加える<BR>
-↓ 15,000 rpm、4 Cで2分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる<BR>
 ↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
 ↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす<BR>
@@ Line 127: / Line 127: @@
 <BR>
-↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37 C(API2-MALT1は30 C)で一晩培養する<BR>
+↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する<BR>
 ↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-↓2 mlのLB培地で37 C(API2-MALT1は30 C)で一晩振とう培養する<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する<BR>
-↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4 Cで5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
 ↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする<BR>
 ↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
@@ Line 136: / Line 136: @@
 ↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
 ↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓15,000 rpm、4 Cで10分間遠心する<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する<BR>
 ↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する<BR>
 ↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
@@ Line 145: / Line 145: @@
 ↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
 ↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
-↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37 Cで培養する<BR>
+↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する<BR>
 <BR><BR>
@@ Line 156: / Line 156: @@
 ↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる<BR>
-<tr><td><table border=1 width="300px">
+<tr><td><table border=1 width="230px">
-<tr><td width="100px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
+<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
 <tr><td align=center>★DNAサンプル入力</td><td align=right>★入力</td></tr>
 <tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 ml</td></tr>
@@ Line 170: / Line 170: @@
 ↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る<BR>
 ↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える<BR>
-↓42-50 Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす<BR>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす<BR>
 ↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する<BR>
 ↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる<BR>
@@ Line 186: / Line 186: @@
 ↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする<BR>
-濃度を書く
 <BR><BR>
+<p><strong>ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</strong></p>
+<table border="0"><tr><td>テーブルタグ</td><td>テーブルタグ2</td></tr></table>
+<font color="#ec6d71">れお、中川くんのやつ</font>
+下記の組成に従って試薬をまぜる
+右に示したプログラムで反応を行う
+<table border="0"><tr><td>
+<table border=1 width="250px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>全量 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border=1 width="300px">
+<tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px"  align=right>95°C、30秒</td></tr>
+<tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr>
+<tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr>
+<tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
 </body>
 </html>