Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

From 2011.igem.org

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         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>   
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　　　  62 ゜C<br>
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R primer<br>
  　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
  　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
Tm値<br>       
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       GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
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+
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R primer<br>
R primer<br>
       GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
       GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
Tm値<br>
Tm値<br>
-
       56.5 ゜C<br>  
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         GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<BR>
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Tm値<br>
-
         62゜C<br>
+
         62°C<br>
R primer<br>  
R primer<br>  
         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>  
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-
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     　　約1514 bp<br>
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【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
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【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
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上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/1f/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%94.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e9/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%91.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-
 
+
【結果】<br>
-
 
+
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。<br>
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-
 
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9月18日（日）<br>
9月18日（日）<br>
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【目的】<br>
【目的】<br>
-
コンピテントセルの作成<br>
+
コンピテントセル（DH5α）の作成<br>
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【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
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【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
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【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+
↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
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【目的】<br>
【目的】<br>
-
コンピテントセルの作成<br>
+
コンピテントセル(DH5α)の作成<br>
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【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
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【実験操作】<br>
【実験操作】<br>
↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
-
↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓氷上で10 min保冷した。<BR>
↓氷上で10 min保冷した。<BR>
-
↓4°Cで10min低速遠心した。<BR>
+
↓4°Cで10min遠心(5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
Line 630: Line 628:
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
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-
<br>
 
-
9月28日（水）<br>
 
-
松浪<br>
 
-
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【目的】<br>
 
-
コンピテンシーの測定<br>
 
-
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-
【実験操作】<br>
 
<br>
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Latest revision as of 09:17, 4 October 2011

9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 °C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。


9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 °C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 °C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62°C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ
　　約1514 bp


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した。



9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
API2-MALT1
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x L Buffer5 µl
Nhe Ⅰ1 µl
 total 50 µl


9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。


9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル（DH5α）の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl


9月22日（木）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl


9月23日（金）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。
DIAP22 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。


9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル(DH5α)の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加した。
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。


9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 103 g)した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min遠心(5 x 103 g)した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。



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