Team:KIT-Kyoto/nakagawa9月2

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9/14
(目的)
GFPのゲル抽出
(方法)

<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用してゲルからGFPのDNAを抽出した。

その後吸光度計を使って濃度の測定をした。

1回目	0.158
2回目	0.147
3回目	0.160
4回目	0.159
5回目	0.158
ave.	0.156

(結果)
ゲルからの抽出は成功して吸光度計での測定で156ng/µlを記録した
翌日から再度ライゲーションの実験に入ることにした
9/15
(目的)
GFP、ベクターのライゲーションとベクターのプレカルチャー
(方法)
それぞれの濃度は156ng/µlと25 ng/µlだった。

そこで先の失敗より濃度の割合を変えて下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、形質転換を行った。

(結果)
ライゲーションに関しては翌日のコロニーの育成は見られなかった
プレカルチャーした大腸菌は数本赤色残り白色といった色の違いが出来ていたが無事に増えて濁っていた

9/16
(目的)
GFPとベクターのライゲーション、育成した大腸菌のアルカリミニプレップ、プレカルチャー
(方法)
それぞれの濃度は156ng/µlと25 ng/µlだった。

そこで先の失敗より濃度の割合を変えるだけでなく回復培養を行った。下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた

(結果)
GFPのコロニーの育成はほとんど見られなかった
大腸菌は途中でDNAが消えてしまい精製することが不可能になった

9/17
(目的)
GFPとベクターのライゲーション、アルカリミニプレップ、プレカルチャー
(方法)
下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた<BR

大腸菌のベクターのアルカリミニプレップとプレカルチャーを行った
このときの留意点として赤いコロニーのみつつくことを心がけてコンタミの可能性を下げることを考えた

(結果)
今度はライゲーション産物におかしな量のコロニーの育成が見られた、もしかしたらコンタミの可能性があると考えられる（抗生物質が効いていない）、ベクターはまた精製することが出来なかった。

9/18
(目的)
プレートチェックをすることにした、ベクターの精製をまたすることにした
(方法)
ベクターのアルカリミニプレップをした
プレートチェックのためにコンピテントセルのみを今まで使っていた培地にまいて増えるかどうかを見てみることにした

(結果)
プレート自体がおかしくなっているのではないかという推測は間違ってはおらず
プレートに生えるはずのないコロニーが出てきているのもあった。
また新しくプレートを明日から作り、抗生物質も新しいものに変えることにした

9/19
(目的)
ベクター、GFPの濃度をもう一度計ってみるために濃度チェックをした
ライゲーションの失敗がコンタミしたプレートによるものであると考えて、新しいプレートでもう一度GFPとベクターを精製しなおすことにした
一応おかしな量ではあるがプレカルチャーをしてみることにした
(方法)
GFPの濃度チェックをするために以下の希釈を行った

1倍希釈	0.019
2倍希釈	0.013
4倍希釈	0.019
8倍希釈	0.022

GFPの濃度チェックのための電気泳動写真 <IMG src=" 2011.09.19_GFP%E6%BF%83%E5%BA%A6%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="250px" height="250px" border="0">

(結果)
GFPの増え方は良好で大きなコロニーの育成が見られた
大腸菌ベクターの方もGFP程ではなかったがある程度の数が生えていたのでよかった
一応白く濁りはしていたので大腸菌の増えていることは確認することが出来た
9/20
(目的)
アルカリミニプレップ、制限酵素処理、MLFの濃度をチェック、ベクターのプレカルチャー
(方法)

(結果)
やはりコンタミしていると思われたコロニーからは何もバンドが形成されずライゲーションは失敗していたことが分かった
MLFのほうは濃度チェックをしてみたところおよそ70ng/µlくらいではないかということが分かりました
9/21
(目的)
プレート作成（濃度を分けて）、昨日の大腸菌のアルカリミニプレップ、プレートチェック
(方法)

(結果)
今度はプレートをクローラムフェ二コールで1000倍希釈500倍希釈250倍希釈していき濃度の違うプレートを作成することが出来た
そして翌日コンピテントセルの育成は見られずプレートの問題はなくなった
大腸菌のDNAの沈殿は見られなかった
9/22
(目的)
ベクターのアルカリミニプレップ、ベクターとGFPのライゲーション
(方法)

(結果)

9/23
(目的)
ベクターのアルカリミニプレップ、プレートチェック(提出用ベクター)
(方法)

(結果)

9/24
(目的) ベクターのアルカリミニプレップ、

(方法)

(結果) 9/25 (目的)

9/26 (目的)

9/27 (目的)

9/28 (目的)

9/29 (目的)

9/30 (目的)

10/2 (目的)

@@ Line 55: / Line 55: @@
 </table>
 <BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
+ライゲーション後、形質転換を行った。<BR>
@@ Line 65: / Line 67: @@
 GFPとベクターのライゲーション、育成した大腸菌のアルカリミニプレップ、プレカルチャー<BR>
 (方法)<BR>
+それぞれの濃度は156ng/µlと25 ng/µlだった。<BR>
+そこで先の失敗より濃度の割合を変えるだけでなく回復培養を行った。
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+提出用ベクター:GFP＝1:2<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>2.0µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.7 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+提出用ベクター:GFP＝1:5<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>2.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+提出用ベクター:GFP＝1:10<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>1.3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.7 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+<BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
+ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた<BR>
@@ Line 75: / Line 112: @@
 GFPとベクターのライゲーション、アルカリミニプレップ、プレカルチャー<BR>
 (方法)<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+提出用ベクター:GFP＝1:2<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>2.0µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.7 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+提出用ベクター:GFP＝1:5<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>2.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+提出用ベクター:GFP＝1:10<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>1.3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.7 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 7 µl</td></tr>
+</table>
+°C、30minでincubateした
+<BR>
+ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた<BR
+大腸菌のベクターのアルカリミニプレップとプレカルチャーを行った<BR>
+このときの留意点として赤いコロニーのみつつくことを心がけてコンタミの可能性を下げることを考えた<BR>
 (結果)<BR>
-今度はおかしな量のコロニーの育成が見られた、もしかしたらコンタミの可能性があると考えられる（抗生物質が効いていない）、ベクターはまた精製することが出来なかった。<BR>
+今度はライゲーション産物におかしな量のコロニーの育成が見られた、もしかしたらコンタミの可能性があると考えられる（抗生物質が効いていない）、ベクターはまた精製することが出来なかった。<BR>
 /18<BR>
@@ Line 84: / Line 154: @@
 プレートチェックをすることにした、ベクターの精製をまたすることにした<BR>
 (方法)<BR>
+ベクターのアルカリミニプレップをした<BR>
+プレートチェックのためにコンピテントセルのみを今まで使っていた培地にまいて増えるかどうかを見てみることにした<BR>
@@ Line 93: / Line 165: @@
 /19<BR>
 (目的)<BR>
-ベクターの濃度をもう一度計ってみるために濃度チェックをした<BR>
+ベクター、GFPの濃度をもう一度計ってみるために濃度チェックをした<BR>
 ライゲーションの失敗がコンタミしたプレートによるものであると考えて、
 新しいプレートでもう一度GFPとベクターを精製しなおすことにした<BR>
 一応おかしな量ではあるがプレカルチャーをしてみることにした<BR>
 (方法)<BR>
+GFPの濃度チェックをするために以下の希釈を行った<BR>
+<table border=1 width="160px">
+<tr><td width="70px" align=center>1倍希釈</td><td width="90px"  align=right>0.019</td></tr>
+<tr><td align=center>2倍希釈</td><td align=right>0.013</td></tr>
+<tr><td align=center>4倍希釈</td><td align=right>0.019</td></tr>
+<tr><td align=center>8倍希釈</td><td align=right>0.022</td></tr>
+</table><BR>
+GFPの濃度チェックのための電気泳動写真
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/5/52/2011.09.19_GFP%E6%BF%83%E5%BA%A6%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>