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Team:KIT-Kyoto/GFP-MLF実験９月
From 2011.igem.org
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【実験方法】<BR> | 【実験方法】<BR> | ||
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Latest revision as of 09:14, 3 October 2011
GFP-MLFまとめ９月！
9/1(木)
中川
ゲルからのDNA抽出
【目的】
pSB1C3のバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。
【実験方法】
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbp マーカー | 3 ml |
| pSB1C3 | 50 µl |
| Lording Dye | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
濃度測定は吸光度計を用いて測った。
その際、吸光度は5回の平均値を算出したものを用いた
1回目,0.019
2回目,0.013
3回目,0.019
4回目,0.022
5回目,0.016
寄って平均値は0.0178で濃度は17.8ng/μlと算出された
【結果】
泳動後の写真
約2kbのところにバンドが見られた。
★いつこのプライマー設計をしたかの記述がない★
GFPのフレームシフトが懸念されたのでその不安材料をのぞくために新たなプライマーを作成しPCRにかけた
GFP改良版のPCR
|
|
上記の組成に従って混ぜた
(結果)
PCRに関しては翌日電気泳動で確認したところあるべきバンドが出ていたので成功しているといえた
9/2(金)
中川
(目的)
GFPのフェノクロ処理(PCR産物のためにアルカリミニプレップは除外する)、電気泳動、制限酵素処理
昨日PCRをかけたGFPのいらないプライマーを除去するためにフェノクロ処理を行った。
フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
GFPの電気泳動(PCR増幅チェック
ゲル1枚当たりの組成
| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した
|
(結果)
GFPはあるべき場所で出ていたしフェノクロ処理後のバンドも濃度としてははっきりしていたので充分採れていたのでよかった
9/3(土)
(目的)
DNAのゲルからの抽出
【目的】
GFPのバンド部分をゲルから切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。
【実験方法】
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した。
【結果】
★9/3の切り出しの写真があったので吉村さんに渡す★
9/5(月)
中川
pSB1C3と開始コドン抜きGFPのライゲーションと形質転換
【目的】
新しいiGEMパーツの製作
【実験方法】
昨日精製したGFPとpSB1C3のライゲーションを行った。
それぞれの濃度は19 ng/µlと25 ng/µlだった。
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
| insert | 0.5 µl |
| vector | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 2.5 µl |
| F4 ligase | 0.5 µl |
| ddH2O | 1.0 µl |
| total 5 µl |
16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、形質転換を行った。
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショクを与えた
↓LB(+クロラムフェニコール)プレートに塗った
↓37°Cで一晩インキュベートした
【結果】
コロニーは全く生えていなかった。
だが昨年度もライゲーションは成功確率が低いということでインサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションをすることに決めた。
9/6(火)
吉村、中川
pSB1C3と開始コドン抜きGFPのライゲーションと形質転換
【目的】
新しいiGEMパーツの製作
【実験方法】
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した
| insert | 0.5 µl |
| vector | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 2.5 µl |
| F4 ligase | 0.5 µl |
| ddH2O | 1.0 µl |
| total 5 µl |
16°C、30minでincubateした
↓ただ今回は工夫点としてベクターとインサートの濃度比を1:9にしてみた
↓そして昨日と同様にトラフォを行うことにした
トランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した
【実験結果】
翌日4つのコロニーが確認できた。
プライマー設計
【目的】
pUAST Fiag-tag dMLFからFiag-tag dMLFを単離・増殖させる。
【実験方法】
ｐUAST Fiag-tag dMLFからの Fiag-tag dMLFの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【実験結果】
F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:72.14℃ 38塩基
R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC 9/12(月)
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:72.16℃ 40塩基
吉村、中川
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
PCR条件(2)
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/13(火)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
【考察】
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。
Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl 10 x H Buffer 3 µl total 30 µl
(2)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
(3)
MilliQ 6 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.2 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。
【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーのラダーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。
PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる
【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
9/14(水)
吉村
アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。
【実験方法】
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.4 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 30minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れることがなかった。
Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。
9/17(土)
吉村・横井川
ライゲーション
9/19(月)
トランスフォーメーション
【目的】
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振とう培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した
【結果】
制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる。
【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl 10 x H Buffer 3 µl total 30 µl
(2)
MilliQ 6.5 µl Flag-tag dMLF 20 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
(3)
MilliQ 6 µl Flag-tag dMLF 20 µl PstⅠ 0.5 µl XbaⅠ 0.5 µl 10 x M Buffer 3 µl total 30 µl
37゜Cで18時間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。
ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar 0.4 g 1 x TAE 20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
泳動後の写真
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
9/20(火)
アルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からプラスミドDNAを回収、精製する。
【実験方法】
Solution I 50 mM グルコース (MW 180) 10 mM EDTA(pH 8.0) 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) Solution II 0.2 N NaOH 1% SDS Solution III 3 M 酢酸カリウム 1.8 M 酢酸
↓前日にプレカルチャーした1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつした
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁した
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心した
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとった
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てた
↓1 mlの70%エタノールを加えた
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かした
【結果】
トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3のバックグラウンドチェック
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した
【結果】
ライゲーション
【目的】
【実験方法】
【結果】
どのプレートにも無数のコロニーが生えていた。
9/22(木)
ライゲーション
【目的】
【実験方法】
【結果】
9/23(金)
トランスフォーメーション
【目的】
【実験方法】
【結果】
