Team:KIT-Kyoto/matsunami/9月

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9月12日（月）
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
　　　 62 °C
R primer
　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。

9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

＊プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 °C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 °C
増幅サイズ　　約3131 bp
　

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。

9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min 40sec
End	4°C	keep

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊プライマーの塩基配列
・DIAP2
F primer
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値
62°C
R primer
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値
66.4°C
増幅サイズ
　　約1514 bp

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

API2-MALT1

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x L Buffer	5 µl
Nhe Ⅰ	1 µl
	total 50 µl

9月17日（土）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。

DIAP2	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。

9月18日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル（DH5α）の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。

9月19日（月）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。

9月21日（水）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

【目的】
・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	33 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

9月22日（木）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。
↓15000g、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000g、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

9月23日（金）

松浪

【目的】
制限酵素処理の確認

【実験操作】
制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。

DIAP2	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。

9月25日（日）

松浪

【目的】
コンピテントセル(DH5α)の作成

【実験操作】

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解した。
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加した。
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。

↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。

9月27日（火）

松浪

【目的】
コンピテントセルの作成

【実験操作】
↓OD600＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。
↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10³ g)した。
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓氷上で10 min保冷した。
↓4°Cで10min遠心(5 x 10³ g)した。
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。

@@ Line 16: / Line 16: @@
          GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
 Tm値<br>
-゜C<br>
+°C<br>
 R primer<br>
   　　　　GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
-Tm値<BR>
+Tm値<br>
-.4゜C<br>
+.4°C<br>
 増幅サイズ　　約1514 bp<br>
 <br>
@@ Line 33: / Line 33: @@
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
@@ Line 46: / Line 46: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
@@ Line 73: / Line 73: @@
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f4/2011.09.13_DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
-<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；DIAP2<br>
+期待される場所にバンドが見られた。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 107: / Line 108: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 119: / Line 120: @@
        GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
 Tm値<br>
-.8 ゜C<br>
+.8 °C<br>
 R primer<br>
        GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
 Tm値<br>
-.5 ゜C<br>
+.5 °C<br>
 増幅サイズ　　約3131 bp<br>
 <br>
@@ Line 139: / Line 140: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/ed/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%92.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 150: / Line 154: @@
 【実験方法】<br>
 以下の条件でPCRを行った。<BR>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+・DIAP2<br>
 <table border="0"><tr><td>
 <table border="0" width="150px">
@@ Line 186: / Line 221: @@
          GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<BR>
 Tm値<br>
-゜C<br>
+°C<br>
 R primer<br>
-         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
+         GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
 Tm値<BR>
-.4゜C<br>
+.4°C<br>
 増幅サイズ<BR>
       　　約1514 bp<br>
@@ Line 207: / Line 242: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/8/86/2011.09.15_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1<br>
+DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 214: / Line 253: @@
 【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
 ↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 ↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 ↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 ↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 ↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
 ↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
 ↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
 ↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
@@ Line 253: / Line 292: @@
-°Cで20時間静置した。
+°Cで20時間静置した。<br>
 <BR>
+<br>
+<br>
 月16日（金）<br>
 <br>
@@ Line 266: / Line 305: @@
 【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
 ↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 ↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 ↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
 ↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
 ↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
-↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
+↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
 ↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
 ↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
 ↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
 <br>
 下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>API2-MALT1</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x L Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Nhe</I> Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</TD></TR>
+</TABLE>
+<br>
+<br>
+月17日（土）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+制限酵素処理の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>DIAP2</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e9/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%91.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。<br>
+<br>
 <br>
 月18日（日）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテントセル（DH5α）の作成<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<BR>
+SOB培地(1 L)
+<tr><td><table border=1 width="200px">
+<tr><td width="150px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>20 g</td></tr>
+<tr><td align=center>bacto yeast extract</td><td align=right>5 g</td></tr>
+<tr><td align=center>5M NaCl</td><td align=right>2 mL</td></tr>
+<tr><td align=center>2K KCl</td><td align=right>1.25 mL</td></tr>
+</table>
+<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。<BR>
+<BR>
+Transformation Buffer(TB)
+<table border=1 width="150px">
+<tr><td width="100px" align=center>PIPES</td><td width="50px" align=right>1.5 g</td></tr>
+<tr><td align=center>CaCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.1 g</td></tr>
+<tr><td align=center>KCl</td><td align=right>9.3 g</td></tr>
+</table>
+<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解した。<BR>
+↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせるた。<BR>
+↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加した。<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。<BR>
+<BR>
+↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。<BR>
+<br>
+月19日（月）<br>
 <br>
 松浪<br>
@@ Line 286: / Line 414: @@
 【目的】<br>
 コンピテントセルの作成<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
+<br>
+<br>
+月21日（水）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテントセルの作成<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+上記の条件でPCRを行った。<br>
+<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/4/44/2011.09.21_DIAP2.2-7.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2<br>
+全てのサンプルでPCRが成功した。<br>
+<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の制限酵素処理<br>
+<br>
+【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
+↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
+<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+<br>
+月22日（木）<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の制限酵素処理<br>
+<br>
+【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
+↓10000g、4°Cで2～3min遠心した。<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した。<BR>
+↓15000g、4°Cで10min遠心した。<BR>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
+↓15000g、4°Cで5min遠心した。<BR>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
+<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+<br>
+月23日（金）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+制限酵素処理の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+制限酵素処理を行ったDIAP2について以下の操作を行った。<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>DIAP2</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで50 V,60minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/1f/%E6%9D%BE%E6%B5%AA%EF%BC%94.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。<br>
+<br>
+<br>
+月25日（日）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+コンピテントセル(DH5α)の作成<br>
 <br>
 【実験操作】<br>
@@ Line 300: / Line 586: @@
 <BR>
-↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れた。<BR>
-↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌した。<BR>
 <BR>
@@ Line 314: / Line 600: @@
 <BR>
-↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解する<BR>
+↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解した。<BR>
-↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる<BR>
+↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせた。<BR>
-↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加する<BR>
+↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加した。<BR>
-↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存した。<BR>
 <BR>
-↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する<BR>
+↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養した。<BR>
-↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する<BR>
+<br>
-↓OD<sob>600</sub>＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する<BR>
+<br>
-↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
+月27日（火）<br>
-↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
+<br>
-↓氷上で10 min保冷する<BR>
+松浪<br>
-↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
+<br>
-↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
+【目的】<br>
-↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する<BR>
+コンピテントセルの作成<br>
-↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む<BR>
+<br>
-↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する<BR>
+【実験操作】<br>
+↓OD<sob>600</sub>＝0.478に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却した。<BR>
+↓4°Cで10min遠心(4.5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
+↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
+↓氷上で10 min保冷した。<BR>
+↓4°Cで10min遠心(5 x 10<sup>3</sup> g)した。<BR>
+↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁した。<BR>
+↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷した。<BR>
+↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込んだ。<BR>
+↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存した。<BR>
+<br>
+<br>