Team:KIT-Kyoto/matsunami/8月

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8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	56.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値　57.8°C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5°C
増幅サイズ　　約3131 bp

8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。

【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。

8月10日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	56.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。

8月11日（木）

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。

8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

midi prep

invitrogen PureLink^TM HiPure Plasmid DNA Purification Kitsを使用する
【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH₂O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH₂O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1

0.189

0.208

0.192

0.190

0.191

平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5

0.282

0.276

0.278

0.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】

8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	58.9°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。

8月16日（火）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	58.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

8月17日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

８/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	68°C	3min20sec
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

8月24日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）
バンドは何も見られなかった。

8月25日（木）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

@@ Line 34: / Line 34: @@
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 66: / Line 66: @@
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 81: / Line 81: @@
 ・DIAP2<br>
 F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
-Tm値　69゜C<br>
+Tm値　69°C<br>
 R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
-Tm値　66.4゜C<br>
+Tm値　66.4°C<br>
 増幅サイズ　　約1514 bp<br>
 <br>
 ・API2-MALT1<br>
-F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
+F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
-Tm値　57.8゜C<br>
+Tm値　57.8°C<br>
 R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
-Tm値　56.5゜C<br>
+Tm値　56.5°C<br>
 増幅サイズ　　約3131 bp<br>
 <br>
 <br>
 月9日（火）<br>
 <br>
@@ Line 110: / Line 108: @@
 <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 </table>
 <br>
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2<br>
+つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。<br>
 <br>
 <br>
 【目的】<br>
 pUAST溶液の形質転換<br>
 【実験操作】<br>
 ↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。<br>
 ↓これを氷上で15min放置した。<br>
 ↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。<br>
 ↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。<br>
 <br>
+<br>
 月10日（水）<br>
 <br>
@@ Line 142: / Line 135: @@
 <br>
 【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
 <table border="0"><tr><td>
 <table border="0" width="150px">
@@ Line 163: / Line 157: @@
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 170: / Line 164: @@
 </td></tr>
 </table>
 <BR>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
 下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
 右に示したプログラムで反応を行った。<br>
@@ Line 183: / Line 205: @@
 ↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。<br>
 ↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。<br>
 <br>
+<br>
 月11日（木）<br>
 <br>
@@ Line 195: / Line 216: @@
 <br>
 【実験操作】<br>
-↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
+↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
 ↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。<br>
 ↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
 ↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
-↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
+↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
 ↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。<br>
-↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
+↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
-↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
+↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
 ↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。<br>
 　<br>
@@ Line 218: / Line 239: @@
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/21/2011.08.11_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2<br>
+pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。<br>
+<br>
 <br>
 月12日（金）<br>
 <br>
@@ Line 230: / Line 252: @@
 vectorの大量精製<br>
 <br>
+<BR>
+<p><strong>midi prep</strong></p>
+<a herf="http://toolsja.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_dna_purification_man.pdf">invitrogen PureLink<sup>TM</sup> HiPure Plasmid DNA Purification Kits</a>を使用する<BR>
 【実験操作】<br>
 ↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
@@ Line 250: / Line 278: @@
 サンプル1<br>
 <table border=1 width="500px">
-<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr><table>
+<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr></table>
 <br>
+平均は0.194であった。<br>
-　平均は0.194であった。<br>
 これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。<br>
 <br>
 サンプル5<br>
 <table border=1 width="500px">
-<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr><table>
+<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr></table>
 <br>
 平均は0.275でった。<br>
 これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。<br>
 <br>
 【目的】<br>
@@ Line 279: / Line 302: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.14_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
 <br>
 <br>
 月15日（月）<br>
@@ Line 316: / Line 338: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 346: / Line 368: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 352: / Line 374: @@
 </td></tr>
 </table>
 <BR>
 下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
 右に示したプログラムで反応を行った。<br>
@@ Line 374: / Line 392: @@
 <br>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/0/0c/2011.08.15_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。<br>
+<br>
 <br>
 月16日（火）<br>
@@ Line 409: / Line 428: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 439: / Line 458: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 445: / Line 464: @@
 </td></tr>
 </table>
 <br>
 【目的】<br>
@@ Line 465: / Line 478: @@
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/c3/2011.08.16_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
-<br>
+レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 503: / Line 515: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 533: / Line 545: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 539: / Line 551: @@
 </td></tr>
 </table>
+<br>
 【目的】<br>
 　PCR産物の確認<br>
@@ Line 556: / Line 565: @@
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/9/98/2011.08.17_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。<br>
+<br>
 <br>
 ８/23(火)<br>
 <br>
@@ Line 594: / Line 602: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
@@ Line 624: / Line 632: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
 </td></tr>
 </table>
+<br>
 上記の条件でPCRを行った。<br>
 <br>
@@ Line 647: / Line 652: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
-<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/6/68/2011.08.23_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 681: / Line 689: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 702: / Line 710: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e6/2011.08.24_API2-MALT1_10.100%E5%80%8D%E5%B8%8C%E9%87%88.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）<br>
+バンドは何も見られなかった。<br>
 <br>
 <br>
@@ Line 735: / Line 747: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
 <tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
@@ Line 766: / Line 778: @@
 <tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 </table>
@@ Line 787: / Line 799: @@
 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
 EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/7/72/2011.08.25_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。<br>