Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 μl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbpマーカー	5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector	50 µl
Lording Dyi	10 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cyle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	100sec
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた

9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH₂O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 μlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 μl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土)
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/18(日)
横井川
LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した

ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/20（火）
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

ゲル抽出
【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

100bp マーカー	3 μl
MLF	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
濃度は70 ng/μlだった。

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

【結果】

9/21（水）
LBプレート作成

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製した
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

【結果】

9/22（木）
ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

9/23
ライゲーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション
【実験方法】

9/24
プレカルチャー
【目的】 pSB1C3の増殖
【実験方法】

9/25
濃度チェック
【目的】電気泳動によるGFPの濃度測定
【実験方法】

ライゲーション
【目的】 pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

9/26
ゲル抽出
【目的】 MLF,pSB1C3 vectorの精製
【実験方法】ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 μl
MLF or pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した

9/27
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理後のpSB1C3の精製
【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
サンプル①の濃度は30 ng/μl サンプル②の濃度は22 ng/μl サンプル③の濃度は26 ng/μl
サンプル④の濃度は24 ng/μl サンプル⑤の濃度は22 ng/μl サンプル⑥の濃度は29 ng/μl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした
↓

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーが見られなかった

9/28
制限酵素処理
【目的】
pSB1C3の調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。

MilliQ	6 µl
pSB1C3	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
GFPのコロニーが見られた

@@ Line 11: / Line 11: @@
 武田、横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<BR>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：<i>Xho</i> I）<br>
@@ Line 68: / Line 69: @@
 武田、横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
 PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：<i>Xho</i> I)<br>
@@ Line 81: / Line 83: @@
 ↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
 ↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
-↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 &micro;l加えた<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
 ↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 ↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
 ↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
-※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
 <br>
 <strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
-下記の組成に従って反応液を調整する<br>
 <table border="0"><tr><td>
 <table border="0">
@@ Line 110: / Line 109: @@
 <tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
-</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する <br>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した <br>
 /31(水)<BR>
 武田、横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
-制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<br>
+制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
 <BR>
 【実験操作】<BR>
 ゲルからのDNA抽出<br>
 <a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 ↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
@@ Line 166: / Line 164: @@
 /1(木)<BR>
 武田<BR>
-<BR>
+<br>
+PCR<BR>
 【目的】<br>
 DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
@@ Line 225: / Line 224: @@
 ↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
 ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+【結果】<br>
+正しい位置にバンドが確認できた
 <br>
@@ Line 232: / Line 232: @@
 /5(月)<BR>
 横井川<BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<BR>
-PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 291: / Line 292: @@
 横井川<BR>
 <BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
-PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 308: / Line 310: @@
 ↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 ↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
-↓ddH<sub>2</sub>Oを44 &micro;l加えてvoltexした<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 μl加えてvoltexした<br>
   <br>
@@ Line 335: / Line 337: @@
 /7(水)<BR>
 横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
-制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出<BR>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 346: / Line 349: @@
 <tr><td><table border="1" width="230">
-<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 ml</td></tr>
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 ml</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 ml</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
 </table>
@@ Line 356: / Line 359: @@
 ↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
 ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 <BR>
 <BR>
@@ Line 367: / Line 369: @@
 /17（土)<BR>
+制限酵素処理<br>
 【目的】<br>
-PCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 397: / Line 400: @@
 <tr><td align="center">NaCl</td><td align="right">10 g</td></tr>
 </table>
 <br>
 ↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた<br>
 ↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした<br>
@@ Line 411: / Line 410: @@
+ゲル抽出<br>
 【目的】<BR>
-制限酵素処理したPCR産物のゲル抽出<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製<BR>
 <BR>
 【実験操作】<br>
@@ Line 422: / Line 422: @@
 <tr><td><table border="1" width="230">
-<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 ml</td></tr>
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 ml</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 ml</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
 </table>
 ↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 ↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
 ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br></p>
 <BR>
 <BR>
 【結果】<BR>
 バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
 <BR>
 <BR>
@@ Line 448: / Line 443: @@
 ゲル電気泳動<BR>
 <BR>
 ゲル1枚当たりの組成
 <tr><td><table border="1" width="200">
@@ Line 454: / Line 448: @@
 <tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
 </table>
 <br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
-↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
-↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
-↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
-↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
-↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
-↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
-↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<br>
 <br>
 <BR>
+ゲル抽出<br>
 【目的】<br>
 MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製<br>
@@ Line 471: / Line 464: @@
 【実験方法】<br>
 ゲルからのDNA抽出<br>
 <a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 ↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 ↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 <tr><td><table border="1" width="230">
-<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 ml</td></tr>
+<tr><td width="130" align="center">100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 <tr><td align="center">
-MLF</td><td align="right">50 ml</td></tr>
+MLF</td><td align="right">50 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 ml</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 </table>
 ↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
@@ Line 511: / Line 500: @@
 <br>
 <br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFのライゲーション産物の増殖<br>
@@ Line 523: / Line 513: @@
 ↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 ↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+【結果】<br>
 <br>
 <br>
 <br>
 /21（水）<br>
 LBプレート作成<BR>
@@ Line 535: / Line 524: @@
 <tr><td align="center">bacto-agar</td><td align="right">15 g/l</td></tr>
 </table>
 <br>
 ↓LB培地を作製した<br>
 ↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した<br>
@@ Line 547: / Line 534: @@
 <br>
+ライゲーション<br>
 【目的】<br>
 pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
@@ Line 554: / Line 541: @@
 <br>【実験方法】<br>
 <br>
-<br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFのライゲーション産物の増殖<br>
@@ Line 562: / Line 549: @@
 ↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 ↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
-↓DNAをチューブに3 &micro;l加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 ↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
-↓60 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 ↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 ↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
@@ Line 570: / Line 557: @@
 <br>
-<br>
+【結果】<br>
 <br>
 /22（木）<br>
+ライゲーション<br>
 【目的】<br>
 pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
@@ Line 579: / Line 567: @@
 【実験方法】<br>
 <br>
+トランスフォーメーション<br>
 【目的】<br>
 MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<br>
@@ Line 588: / Line 577: @@
 ↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 ↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
-↓60 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 ↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 ↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
@@ Line 630: / Line 619: @@
 ↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 ↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
-↓60 &micro;lのSOC培地を加えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 ↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 ↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
@@ Line 640: / Line 629: @@
 MLF,pSB1C3 vectorの精製<br>
 【実験方法】
-<p><strong>ゲルからのDNA抽出</strong></p>
+ゲルからのDNA抽出<br>
-<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
-↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった<BR>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
-↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<BR>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
-<tr><td><table border=1 width="230px">
+<tr><td><table border="1" width="230">
-<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 μl</td></tr>
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
-<tr><td align=center>MLF or pSB1C3 vector</td><td align=right>50μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
-<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 μl</td></tr>
+MLF or pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 </table>
-↓50 Vで60分間電気泳動した<BR>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
-↓EtBrでゲルを40分間染色した<BR>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
-↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<BR>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
-↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<BR>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
-↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<BR>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
-↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
-↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<BR>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
-↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<BR>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
-↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
-↓カラムにサンプルをのせた<BR>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
-↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
-↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<BR>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
-↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
-↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<BR>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
-↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
-↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
-↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
-↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
-↓37 µlのMilliQを加えた<BR>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
-↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 <br>
 /27<br>
-<BR>
+ゲル抽出<BR>
 【目的】<BR>
+制限酵素処理後のpSB1C3の精製<BR>
+【実験方法】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
+【結果】<BR>
+サンプル①の濃度は30 ng/μl  サンプル②の濃度は22 ng/μl  サンプル③の濃度は26 ng/μl<BR>
+サンプル④の濃度は24 ng/μl  サンプル⑤の濃度は22 ng/μl  サンプル⑥の濃度は29 ng/μl<BR>
 <BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
 【実験方法】<BR>
+↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした<BR>
+↓
+<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<BR>
+【目的】<BR>
+MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<BR>
+【実験方法】<BR>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+コロニーが見られなかった<BR>
 <BR>
 /28<BR>
+制限酵素処理<BR>
 【目的】<BR>
+pSB1C3の調整<BR>
+【実験方法】<BR>
+下表に従って、制限酵素処理を行った。<BR>
 <BR>
+<tr><td><table border=1 width="220px">
+<tr><td width="130px" align=center>MilliQ</td><td width="90px"  align=right>6 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>pSB1C3</td><td align=right>20 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Xba</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 30 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+<BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
 【実験方法】<BR>
+vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
+</table>
 <BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+GFPのコロニーが見られた
+<BR>
 </p>