Team:Lyon-INSA-ENS/Realisation/Protocols/LigationFr

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This protocol aims at ligating compatible, previously cut restriction sites on plasmids. Volumes of DNA are given for similar concentrations. You may want to adapt these volumes if your concentrations are significantly different. Enzymes and buffers were supplied by Fermentas.
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Ce protocole permet de liguer des plasmides par leurs sites de restriction compatibles, précédemment coupés. Les volumes d'ADN sont donnés pour des concentrations similaires pour l'insert et le vecteur et doivent être adaptés si ces concentrations sont trop différentes. L'enzyme ligase et le tampon T4 DNA ligase ont été fournis par Fermentas.  
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<p style="text-align : center"> <font color="green" size="5"> Procedure </font> </p>
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<p style="text-align : center"> <font color="green" size="5"> Procédure </font> </p>
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<b>1. Standard ligation</b> In an eppendorf tube, add the following solutions :<br/>
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<b>1. Ligation standard </b> Dans un tube Eppendorf, ajouter les solutions suivantes:<br/>
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- 6 µL insert<br/>
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- 6 µL d'insert<br/>
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- 4 µL vector<br/>
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- 4 µL de vecteur<br/>
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- 2 µL T4 DNA ligase buffer<br/>
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- 2 µL de tampon T4 DNA ligase <br/>
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- 6 µL water<br/>
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- 6 µL d'eau <br/>
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<b>Or 1. 3A ligation</b> In an eppendorf tube, add the following solutions :<br/>
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<b>Or 1. Ligation 3A </b> Dans un tube Eppendorf, ajouter les solutions suivantes:<br/>
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- 2 µL of each DNA solution <br/>
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- 2 µL de chaque solution d'ADN <br/>
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- 2 µL T4 DNA ligase buffer <br/>
+
- 2 µL de tampon T4 DNA ligase <br/>
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- 10 µL water<br/>
+
- 10 µL d'eau <br/>
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<b>2.</b> Add 2µL of ligase.
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<b>2.</b> Ajouter 2µL de ligase.
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<b>3.</b> Incubate at room temperature for 3h
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<b>3.</b> Incuber à température ambiante pendant 3h.
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<b>4.</b> Incubate at 70°C for 5 mn to inactivate the ligase.
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<b>4.</b> Incuber à 70°C pendant 5 min afin d'inactiver la ligase.
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Latest revision as of 13:54, 22 August 2011





Ligation





Ce protocole permet de liguer des plasmides par leurs sites de restriction compatibles, précédemment coupés. Les volumes d'ADN sont donnés pour des concentrations similaires pour l'insert et le vecteur et doivent être adaptés si ces concentrations sont trop différentes. L'enzyme ligase et le tampon T4 DNA ligase ont été fournis par Fermentas.





Procédure



1. Ligation standard Dans un tube Eppendorf, ajouter les solutions suivantes:
- 6 µL d'insert
- 4 µL de vecteur
- 2 µL de tampon T4 DNA ligase
- 6 µL d'eau

Or 1. Ligation 3A Dans un tube Eppendorf, ajouter les solutions suivantes:
- 2 µL de chaque solution d'ADN
- 2 µL de tampon T4 DNA ligase
- 10 µL d'eau


2. Ajouter 2µL de ligase.


3. Incuber à température ambiante pendant 3h.


4. Incuber à 70°C pendant 5 min afin d'inactiver la ligase.








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