From Monday the 1st of August to Friday the 5th of August 2011

Monday

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24 well plate with LB/2 or M63 medium to test bacterial adherence in response to cobalt :
positive control with an adherent strain PHL818 ( MG1655 malT::Tn10 adr101=OmpR234 ),negative control with a non adherent strain NM522, and our synthesized part Rcn-CsgBAEFG (Amp) with increasing concentrations of cobalt ( in CoCl2 form).

Flocculation test for the same strains with LB/2 or M63 medium.

Miniprep of the transformed colonies with the following plasmids : Prcn / Pcurli-GFP / Pcurli - Operon curli.
-> none of the isolated clones had the Prcn or Pcurli-GFP plasmid, start of liquid culture of new clones.
-> two clones had the Pcurli-curli operon part : storage in the collection

Tuesday

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In LB/2, the flocculation tests show flocculation for the adherent strain (PHL818), none for the negative control. Our strain shows a small flocculation that increases with the concentration in cobalt.
No flocculation in M63 medium for our strain : LB/2 will be used only for the next tests.

New flocculation tests with a wider range of cobalt concentration in LB or LB/2 and using the Rcn-CsgBAEFG (Cm) synthesized part

Revealing of the 24 well plate from the previous day, using 2 different methods : methyl violet (to visualise the formation of the biofilm at the surface of the well ) or direct OD600 measure.

Miniprep of the clones started the previous day
-> two clones have the Prcn part and one Pcurli-GFP.

Wednesday

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Mesure de la DO600 des puits de la plaque poussant en LB/2, qui permet de calculer le pourcentage d'adhérence de chacune des souches.

Révélation de la plaque 24 puits en milieu M63. 1/4 des puits sont traités au Cristal Violet, et on prend la DO600 des autres.

Observation des tests de floculations lancés mardi. On observe de meilleurs résultats en milieu LB/2 par rapport au LB , bien qu'ils ne soient pas significatifs. On va donc garder le milieu LB/2 pour nos plaques 24 puits.

Mesure au nona drop des plasmides mis en collection.

Thursday

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On refait des plaques 24 puits, qui permettent de mettre en évidence :

• l'effet du Cobalt (en concentration constante),
• la différence entre la souche Amp résistant et Cm résistant,
• l'effet de l'antibiotique,
• l'effet du traitement de la plaque à l'EDTA,
• l'effet de l'EDTA (en concentration croissante) sur la souche.

Caractérisation de OmpR234, avec une plaque 24 puits et un test de floculation

Test en milieu CFA qui permet de mettre en évidence la formation de Biofilm en le colorant en rouge.
On met sur boîte 10 microL de PHL818 (témoin positif, souche adhérente), de NM522 (témoin négatif), de notre promoteur fort avec et sans la part OmpR234, de notre part de synthèse Amp résistant et celle Cm résistant.

Construction de la part Prcn-GFP(LVA).
digestion du plasmide Prcn avec S et P = linéarisation du plasmide -> erreur : la part sort du plasmide
-> utilisation d'autres tubes d'enzymes, mais mêmes résultats, idem pour la simple digestion -> nos tubes d'enzymes sont contaminés
digestion plasmide RBS fort - GFP avec X et P -> OK

Friday

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Répétition du test de floculation pour la caractérisation de OmpR234.

Répétition du test en milieu CFA.