Team:KIT-Kyoto/DIAP2-MALT実験

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DIAP2-MALT実験系実験ノート

8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	56.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値　57.8°C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5°C
増幅サイズ　　約3131 bp

8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。

【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。

8月10日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	56.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。

8月11日（木）

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
　
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。

8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH₂O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH₂O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1

0.189

0.208

0.192

0.190

0.191

平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5

0.282

0.276

0.278

0.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】

8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	58.9°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。

8月16日（火）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	58.9°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

8月17日（水）

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	53.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	72°C	1min40sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

８/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	53°C	30sec
Extension	68°C	3min20sec
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

8月24日（水）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）
バンドは何も見られなかった。

8月25日（木）

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	51.5°C	30sec
Extension	72°C	3min20sec
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

・DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	1min40sec
End	4°C	keep

上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】

PCR反応液	2 µl
ddH₂O	8 µl
6 x loading dye	2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

【結果】
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 μl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbpマーカー	5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector	50 µl
Lording Dyi	10 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cyle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	100sec
End	4°C	keep

【結果】
正しい位置にバンドが見られた

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた

9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH₂O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 μlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 μl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土)
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

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-DIAP2-MALT実験系実験ノート
+DIAP2-MALT実験系実験ノート<BR>
+<BR>
+<html>
+<head>
+<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+<title></title>
+</head>
+<body>
+<p>
+月8日（月）<br>
+<br>
+松浪、横井川<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA
+vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+<br>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
+右に示したプログラムで反応を行った。<br>
+<br>
+＊&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
+・DIAP2<br>
+F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
+Tm値　69°C<br>
+R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
+Tm値　66.4°C<br>
+増幅サイズ　　約1514 bp<br>
+<br>
+・API2-MALT1<br>
+F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
+Tm値　57.8°C<br>
+R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
+Tm値　56.5°C<br>
+増幅サイズ　　約3131 bp<br>
+<br>
+<br>
+月9日（火）<br>
+<br>
+松浪、横井川<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2<br>
+つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。<br>
+<br>
+<br>
+【目的】<br>
+pUAST溶液の形質転換<br>
+【実験操作】<br>
+↓pUAST　1 µlとコンピテントセルを混合した。<br>
+↓これを氷上で15min放置した。<br>
+↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。<br>
+↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。<br>
+<br>
+<br>
+月10日（水）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA
+vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
+右に示したプログラムで反応を行った。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+大腸菌の培養<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。<br>
+↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2 mlに攪拌した。<br>
+↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。<br>
+<br>
+<br>
+月11日（木）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+pUAST flag
+vectorの大量精製<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓培養液1.5 mLを、15000 g、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。<br>
+↓上清を廃棄しglucose solution　100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。<br>
+↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
+↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。<br>
+↓15000 g、10min、4°Cの条件で遠心した。<br>
+↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。<br>
+↓15000 g、10min、25°Cの条件で遠心した。<br>
+↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 g、10min、25°Cの条件で再び遠心した。<br>
+↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。<br>
+　<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/21/2011.08.11_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2<br>
+pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。<br>
+<br>
+<br>
+月12日（金）<br>
+<br>
+松浪、横井川<br>
+<br>
+【目的】<br>
+pUAST flag
+vectorの大量精製<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。<br>
+↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。<br>
+↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。<br>
+↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。<br>
+↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。<br>
+↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。<br>
+↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。<br>
+↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。<br>
+↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。<br>
+<br>
+↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。<br>
+↓ddH<sub>2</sub>O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。<br>
+↓ddH<sub>2</sub>O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。<br>
+表1、サンプル1、5の吸光度の値<br>
+サンプル1<br>
+<table border=1 width="500px">
+<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr></table>
+<br>
+平均は0.194であった。<br>
+これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。<br>
+<br>
+サンプル5<br>
+<table border=1 width="500px">
+<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr></table>
+<br>
+平均は0.275でった。<br>
+これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.14_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+<br>
+<br>
+月15日（月）<br>
+<br>
+松浪、横井川<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
+右に示したプログラムで反応を行った。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/0/0c/2011.08.15_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。<br>
+<br>
+<br>
+月16日（火）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/c3/2011.08.16_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
+レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。<br>
+<br>
+<br>
+月17日（水）<br>
+<br>
+松浪、横井川<br>
+<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+【目的】<br>
+　PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/9/98/2011.08.17_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。<br>
+<br>
+<br>
+８/23(火)<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+上記の条件でPCRを行った。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/6/68/2011.08.23_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。<br>
+<br>
+<br>
+月24日（水）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e6/2011.08.24_API2-MALT1_10.100%E5%80%8D%E5%B8%8C%E9%87%88.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）<br>
+バンドは何も見られなかった。<br>
+<br>
+<br>
+月25日（木）<br>
+<br>
+松浪<br>
+<br>
+【目的】<br>
+cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+・API2-MALT1<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>3min20sec</td></tr>
+<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+・DIAP2<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<br>
+上記の条件でPCRを行った。<br>
+<br>
+<br>
+【目的】<br>
+PCR産物の確認<br>
+<br>
+【実験操作】<br>
+<table border="1" width="200px">
+<tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+</table>
+上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br>
+EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/7/72/2011.08.25_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+【結果】<br>
+左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2<br>
+API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。<br>
+<br>
+<br>
+/29(月)<BR>
+<BR>
+武田、横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<BR>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：<i>Xho</i> I）<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+※保存する場合 ↓-20°Cで保存した<br>
+<br>
+<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+°Cで20時間静置した
+<br>
+/30(火)<BR>
+武田、横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：<i>Xho</i> I)<br>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した <br>
+/31(水)<BR>
+武田、横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
+<BR>
+【実験操作】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbpマーカー</td><td width="100"  align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2 or PUAST-flag vector</td><td align="right">50 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 µl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 µlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。<BR>
+DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。<BR>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/27/2011.08.31_%E6%A8%AA%E4%BA%95%E5%B7%9DpUAST-flag-vector.JPG" width="240px" height="280px" border="0">
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/1(木)<BR>
+武田<BR>
+<br>
+PCR<BR>
+【目的】<br>
+DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+下記の組成に従って試薬をまぜた<br>
+右に示したプログラムで反応を行った<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150">
+<tr><td align="center">PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="220">
+<tr><td width="150" align="center">10 µM Primer F</td><td width="70"  align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 µM Primer R</td><td align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Template DNA</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x PCR Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">dNTPs</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">MgSO<sub>4</sub></td><td align="right">2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0" width="100">
+<tr><td align="center">Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="400">
+        <tbody>
+<tr><td width="100" align="center">Pre-Denature</td><td width="100"  align="center">94°C</td><td width="100"  align="center">2min</td></td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align="center">Denature</td><td align="center">94°C</td><td align="center">15sec</td><td align="center" rowspan="3">35 Cyle</td></tr>
+<tr><td align="center">Anneling</td><td align="center">50.5°C</td><td align="center">30sec</td></tr>
+<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
+<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+</table></td></tr></tbody></table>
+<br>
+【結果】<BR>
+正しい位置にバンドが見られた<BR>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/d/dd/2011.09.01_%E6%A8%AA%E4%BA%95%E5%B7%9DPCR%E5%BE%8CDIAP2.JPG" width="240px" height="280px" border="0">
+<BR>
+<BR>
+【目的】<BR>
+PCR産物の確認<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+<strong>ゲル電気泳動</strong></p><BR>
+ゲル1枚当たりの組成
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
+<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+【結果】<br>
+正しい位置にバンドが確認できた
+<br>
+<BR>
+<BR>
+/5(月)<BR>
+横井川<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<BR>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(<i>Xho</i> I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/μl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+°Cで20時間静置した
+<br></p>
+</body>
+/6(火)<BR>
+横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+</strong>↓PCR産物を400 μlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 μl加えてvoltexした<br>
+ <br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>
+°Cで20時間静置した
+<br>
+<BR>
+/7(水)<BR>
+横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出<BR>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/17（土)<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した
+<br>
+<BR>