Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

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(Difference between revisions)

Latest revision as of 08:32, 4 October 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

LBプレート

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

トランスフォーメーション

去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する

今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する

回復培養あり
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

アルカリミニプレップ

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす

今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する

ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
★DNAサンプル入力	★入力
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

テーブルタグ

テーブルタグ2

テーブルタグ

れお、中川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cycle
Anneling	(Tm-5)°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

松浪くん、横井川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
★Ex Taqばーじょん！

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
Template DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
2.0 mM dNTPs	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
	total 20 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	30sec	37 Cycle
Anneling	(Tm-5)°C	30sec
Extension	72°C	1kb/min
+Extension	72°C	10min
End	4°C	keep

下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
MgSO₄とddH₂Oの使用した量は各自で変更おねがいします！！
★KOD⁺ばーじょん！

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cycle
Anneling	(Tm-5)°C	30sec
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

コンピテント細胞の作製

もらったフローチャートをもとにつくりましたが、
不安なところがいくつかあるので、違ってたらゆうてください!!!
斜線で訂正してある部分は訂正の値を使いました。

・「OD₆₀₀＝0.4-0.8」は0.6にしたほうがいいのか？
・「4°Cで10min低速遠心する」は13minなのか？

SOB培地(1 L)

bacto tryptone	20 g
bacto yeast extract	5 g
5M NaCl	2 mL
2K KCl	1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる
↓ddH₂Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

Transformation Buffer(TB)

PIPES	1.5 g
CaCl₂H₂O	1.1 g
KCl	9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH₂O 400 mlに溶解する
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる
↓MnCl₂H₂Oを5.45 g添加する
↓ddH₂Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する
↓OD600＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓氷上で10 min保冷する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する

PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）

疑問(´・ω・｀)
このタイトルはこれでいいんかな？

↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)

★XhoⅠばーじょん！
下記の組成に従って反応液を調整する

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置する

★Xba Ⅰ、Nhe Ⅰばーじょんです
下記の組成に従って反応液を調整する

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

API2-MALT1

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x L Buffer	5 µl
Nhe Ⅰ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置する

ligation

下記の組成に従って反応液を調整する

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateする

@@ Line 82: / Line 82: @@
 ↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する<BR>
+<BR><BR>
+回復培養あり<BR>
+↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した<BR>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した<BR>
+↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした<BR>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<BR>
+↓素早く氷上に移し、2分間冷やした<BR>
+↓300 µlのSOC培地を加えた<BR>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<BR>
+↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた<BR>
+↓37°Cで一晩培養した<BR>
 <BR><BR><BR>
@@ Line 152: / Line 165: @@
 <p><strong>ゲルからのDNA抽出</strong></p>
 <a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<BR>
 ↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<BR>
@@ Line 222: / Line 234: @@
 <table border=1 width="400px">
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cyle</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
@@ Line 259: / Line 271: @@
 <table border=1 width="400px">
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cyle</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
@@ Line 298: / Line 310: @@
 <table border=1 width="400px">
 <tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cyle</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
@@ Line 378: / Line 390: @@
 ↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する<BR>
-↓コロニーを500 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する<BR>
+↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する<BR>
 ↓OD<sob>600</sub>＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する<BR>
 ↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
-↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を168 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
+↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
 ↓氷上で10 min保冷する<BR>
 ↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
 ↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
-↓3.0 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する<BR>
+↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する<BR>
 ↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む<BR>
 ↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する<BR>
@@ Line 414: / Line 426: @@
 ↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexする<BR>
-<BR>
 ※保存する場合
 ↓-20°Cで保存する
-<BR>
+<BR><BR>
@@ Line 425: / Line 436: @@
 <BR>
-★<I>Xho</I> Iばーじょんです
+★<I>Xho</I>Ⅰばーじょん！
 <BR>
@@ Line 437: / Line 448: @@
 <tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center><I>Xho</I>I</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
@@ Line 448: / Line 459: @@
 <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center><I>Xho</I> I</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
@@ Line 454: / Line 465: @@
 </TABLE>
-<BR>
 °Cで20時間静置する
 <BR>
-★<I>Xba</I> I、<I>Nhe</I> Iばーじょんです
+<BR>
+★<I>Xba</I> Ⅰ、<I>Nhe</I> Ⅰばーじょんです
 <BR>
 下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
-<BR>
 <TABLE border="0"><TR><TD>
@@ Line 474: / Line 482: @@
 <table border=1 width="200px">
 <tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center><I>Xba</I> I</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
@@ Line 484: / Line 492: @@
 <table border=1 width="200px">
 <tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x L Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Nhe</I> Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</TD></TR>
+</TABLE>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="250px">
+<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center><I>Nhe</I> I</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
@@ Line 492: / Line 514: @@
+°Cで20時間静置する
+<BR><BR>
+<p><b>ligation</b></p>
+<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
+</table>
+<BR>
+°C、30minでincubateする<BR>