Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

From 2011.igem.org

(Difference between revisions)
 
(23 intermediate revisions not shown)
Line 12: Line 12:
<p><strong>LB培地</strong></p>
<p><strong>LB培地</strong></p>
-
<tr><td><table border=1 width="250px">
+
<tr><td><table border=1 width="200px">
-
<tr><td width="200px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>10 g</td></tr>
+
<tr><td width="150px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>10 g</td></tr>
<tr><td align=center>bacto yeast evtract</td><td align=right>5 g</td></tr>
<tr><td align=center>bacto yeast evtract</td><td align=right>5 g</td></tr>
<tr><td align=center>NaCl</td><td align=right>10 g</td></tr>
<tr><td align=center>NaCl</td><td align=right>10 g</td></tr>
Line 25: Line 25:
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす<BR>
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす<BR>
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして<BR>
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして<BR>
-
↓121 ℃で20分オートクレーブ滅菌する<BR>
+
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
Line 32: Line 32:
<p><strong>LBプレート</strong></p>
<p><strong>LBプレート</strong></p>
-
<tr><td><table border=1 width="270px">
+
<tr><td><table border=1 width="170px">
-
<tr><td width="200px" align=center>LB培地</td><td width="70px" align=right>&nbsp;</td></tr>
+
<tr><td width="100px" align=center>LB培地</td><td width="70px" align=right>&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>bacto-agar</td><td align=right>15 g/l</td></tr>
<tr><td align=center>bacto-agar</td><td align=right>15 g/l</td></tr>
</table>
</table>
Line 42: Line 42:
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する<BR>
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する<BR>
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する<BR>
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する<BR>
-
↓65 ℃程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える<BR>
+
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える<BR>
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する<BR>
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する<BR>
↓水平な所に置いて固まらせる<BR>
↓水平な所に置いて固まらせる<BR>
Line 59: Line 59:
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する<BR>
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する<BR>
-
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 μlのコンピテント細胞を分注する<BR>
+
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する<BR>
-
↓余ったコンピテント細胞は-80 ℃の冷凍庫に戻す<BR>
+
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す<BR>
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす<BR>
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす<BR>
-
↓42 ℃で45秒間熱ショックを与える<BR>
+
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える<BR>
↓0.9 mlのSOC培地を加える<BR>
↓0.9 mlのSOC培地を加える<BR>
-
↓37 ℃で1時間、振りながら回復培養する<BR>
+
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する<BR>
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく<BR>
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく<BR>
-
↓37 ℃で一晩培養する<BR>
+
↓37°Cで一晩培養する<BR>
<BR><BR>
<BR><BR>
Line 76: Line 76:
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える<BR>
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える<BR>
↓氷上で15分間冷やす<BR>
↓氷上で15分間冷やす<BR>
-
↓43 ℃で30秒間熱ショクを与える<BR>
+
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える<BR>
↓氷上で10分間冷やす<BR>
↓氷上で10分間冷やす<BR>
-
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で30分間回復培養する<BR>
+
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する<BR>
↓LB(+amp)プレートに塗る<BR>
↓LB(+amp)プレートに塗る<BR>
-
↓37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で培養する<BR>
+
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する<BR>
 +
 +
<BR><BR>
 +
回復培養あり<BR>
 +
 +
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した<BR>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した<BR>
 +
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした<BR>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<BR>
 +
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした<BR>
 +
↓300 µlのSOC培地を加えた<BR>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<BR>
 +
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた<BR>
 +
↓37°Cで一晩培養した<BR>
<BR><BR><BR>
<BR><BR><BR>
Line 88: Line 101:
<p><strong>アルカリミニプレップ</strong></p>
<p><strong>アルカリミニプレップ</strong></p>
-
<tr><td><table border=1 width="300px">
+
<tr><td><table border=1 width="280px">
-
<tr><td width="100px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
+
<tr><td width="80px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
Line 102: Line 115:
<BR>
<BR>
-
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37 ℃で一晩培養する<BR>
+
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する<BR>
↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-
↓2 mlのLB培地で37 ℃で一晩振とう培養する<BR>
+
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する<BR>
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす<BR>
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす<BR>
-
↓15,000 rpm、4 ℃で1分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-
↓100 μlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する<BR>
+
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する<BR>
-
↓200 μlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
-
↓150 μlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
-
↓15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心する<BR>
+
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する<BR>
-
↓400 μlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる<BR>
+
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる<BR>
-
↓900 μlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
+
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
-
↓15,000 rpm、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
↓1 mlの70%エタノールを加える<BR>
↓1 mlの70%エタノールを加える<BR>
-
↓ 15,000 rpm、4 ℃で2分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる<BR>
↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
-
↓プラスミドDNAを30 μlのRNaseのはいったTEに溶かす<BR>
+
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす<BR>
Line 127: Line 140:
<BR>
<BR>
-
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で一晩培養する<BR>
+
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する<BR>
↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-
↓2 mlのLB培地で37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で一晩振とう培養する<BR>
+
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する<BR>
-
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-
↓100 μlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする<BR>
+
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする<BR>
-
↓沈殿物を溶かした後、200 μlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
-
↓150 μlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
↓氷上で5分間冷やす<BR>
-
↓15,000 rpm、4 ℃で10分間遠心する<BR>
+
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する<BR>
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する<BR>
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する<BR>
-
↓450 μlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
+
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-
↓150～200 μlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする<BR>
+
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
↓2分間室温で放置する<BR>
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
-
↓RNaseのはいったTEを20 μl加えて37 ℃で培養する<BR>
+
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する<BR>
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><strong>ゲルからのDNA抽出</strong></p>
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<BR>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<BR>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる<BR>
 +
 
 +
<tr><td><table border=1 width="230px">
 +
<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
 +
<tr><td align=center>★DNAサンプル入力</td><td align=right>★入力</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 ml</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
↓50 Vで60分間電気泳動する<BR>
 +
↓EtBrでゲルを40分間染色する<BR>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<BR>
 +
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす<BR>
 +
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る<BR>
 +
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える<BR>
 +
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす<BR>
 +
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する<BR>
 +
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる<BR>
 +
↓カラムにサンプルをのせる<BR>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる<BR>
 +
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす<BR>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる<BR>
 +
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える<BR>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる<BR>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる<BR>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心する<BR>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる<BR>
 +
↓37 µlのMilliQを加える<BR>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心する<BR>
 +
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする<BR>
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><strong>ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</strong></p>
 +
 
 +
 
 +
<table border="0"><tr><td>テーブルタグ</td><td>テーブルタグ2</td><td>テーブルタグ</td></tr></table>
 +
 
 +
<font color="#ec6d71">れお、中川くんのやつ</font><br>
 +
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
 +
右に示したプログラムで反応を行う<br>
 +
<font color=red>(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！</font><br>
 +
 
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
<font color="#ec6d71">松浪くん、横井川くんのやつ</font><br>
 +
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
 +
右に示したプログラムで反応を行う<br>
 +
<font color=red>(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！</font><br>
 +
 
 +
★Ex Taqばーじょん！<BR>
 +
 
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
 +
右に示したプログラムで反応を行う<br>
 +
<font color=red>(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！</font><br>
 +
<font color=red>MgSO<sub>4</sub>とddH<sub>2</sub>Oの使用した量は各自で変更おねがいします！！</font><br>
 +
 
 +
★KOD<sup>+</sup>ばーじょん！<BR>
 +
 
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x PCR Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl or 4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>33 µl or 31 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><strong>ゲル電気泳動</strong></p>
 +
 
 +
 
 +
ゲル1枚当たりの組成
 +
<tr><td><table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50px" align=right>0.2 g</td></tr>
 +
<tr><td align=center>1 x TAE</td><td align=right>20 ml</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める<BR>
 +
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加える<BR>
 +
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる<BR>
 +
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する<BR>
 +
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する<BR>
 +
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる<BR>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する<BR>
 +
 
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 +
<BR>
 +
 
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<p><strong>コンピテント細胞の作製</strong></p>
 +
 
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もらったフローチャートをもとにつくりましたが、<BR>
 +
不安なところがいくつかあるので、違ってたらゆうてください!!!<BR>
 +
斜線で訂正してある部分は訂正の値を使いました。<BR>
 +
 
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<BR>
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・「OD<sub>600</sub>＝<font color=red>0.4-0.8</font>」は<font color=red>0.6</font>にしたほうがいいのか？<br>
 +
・「4°Cで<font color=red>10min</font>低速遠心する」は<font color=red>13min</font>なのか？<br>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
SOB培地(1 L)
 +
<tr><td><table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>20 g</td></tr>
 +
<tr><td align=center>bacto yeast extract</td><td align=right>5 g</td></tr>
 +
<tr><td align=center>5M NaCl</td><td align=right>2 mL</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2K KCl</td><td align=right>1.25 mL</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる<BR>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
Transformation Buffer(TB)
 +
<table border=1 width="150px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>PIPES</td><td width="50px" align=right>1.5 g</td></tr>
 +
<tr><td align=center>CaCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.1 g</td></tr>
 +
<tr><td align=center>KCl</td><td align=right>9.3 g</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解する<BR>
 +
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる<BR>
 +
↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加する<BR>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する<BR>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する<BR>
 +
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する<BR>
 +
↓OD<sob>600</sub>＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する<BR>
 +
↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
 +
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
 +
↓氷上で10 min保冷する<BR>
 +
↓4°Cで10min低速遠心する<BR>
 +
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する<BR>
 +
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する<BR>
 +
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む<BR>
 +
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する<BR>
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><strong>PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）</strong></p>
 +
 
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疑問(´・ω・｀)<BR>
 +
このタイトルはこれでいいんかな？<BR>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<BR>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする<BR>
 +
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移す<BR>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする<BR>
 +
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<BR>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移す<BR>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する<BR>
 +
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<BR>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える<BR>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<BR>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させる<BR>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexする<BR>
 +
 
 +
※保存する場合
 +
↓-20°Cで保存する
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><strong>制限酵素処理(<I>Xho</I> I)</strong></p>
 +
 
 +
<BR>
 +
★<I>Xho</I>Ⅰばーじょん！
 +
<BR>
 +
 
 +
下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
 +
 
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>cDNA</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>vector</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="250px">
 +
<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width"50px" align=right>10 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
 
 +
 
 +
37°Cで20時間静置する
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
<BR>
 +
★<I>Xba</I> Ⅰ、<I>Nhe</I> Ⅰばーじょんです
 +
<BR>
 +
 
 +
下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
 +
 
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>API2-MALT1</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x L Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Nhe</I> Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
 
 +
 
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>vector</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="250px">
 +
<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xba</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
 
 +
 
 +
37°Cで20時間静置する
 +
 
 +
 
 +
<BR><BR>
 +
 
 +
 
 +
<p><b>ligation</b></p>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
 +
 
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
<BR>
 +
 
 +
16°C、30minでincubateする<BR>
 +
 
 +
 
</body>
</body>
</html>
</html>

Latest revision as of 08:32, 4 October 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone10 g
bacto yeast evtract5 g
NaCl10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する



LBプレート

LB培地 
bacto-agar15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる



トランスフォーメーション


去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する


今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する


回復培養あり
↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した



アルカリミニプレップ

Solution I50 mM グルコース (MW 180)
 10 mM EDTA(pH 8.0)
 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II0.2 N NaOH
 1% SDS
Solution III3 M 酢酸カリウム
 1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす


今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する


ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
★DNAサンプル入力★入力
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする


ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

テーブルタグテーブルタグ2テーブルタグ
れお、中川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling(Tm-5)°C1min
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

松浪くん、横井川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
★Ex Taqばーじょん！
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
MgSO4とddH2Oの使用した量は各自で変更おねがいします！！
★KOD+ばーじょん！
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 


ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

コンピテント細胞の作製

もらったフローチャートをもとにつくりましたが、
不安なところがいくつかあるので、違ってたらゆうてください!!!
斜線で訂正してある部分は訂正の値を使いました。

・「OD600＝0.4-0.8」は0.6にしたほうがいいのか？
・「4°Cで10min低速遠心する」は13minなのか？

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL

↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する

Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g

↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解する
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加する
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する

↓大腸菌をLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養する
↓コロニーを250 mlのSOB培地に植え、18°Cで40～50時間振とう培養する
↓OD600＝0.4-0.8に達しとところで培養を止め、三角フラスコを氷上で10min冷却する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、沈殿した大腸菌を84 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓氷上で10 min保冷する
↓4°Cで10min低速遠心する
↓上澄みを除き、大腸菌を40 mlの氷冷したTBに懸濁する
↓1.5 mlのDMSO(7%)を加え、氷上で10 min保冷する
↓1.0～1.8 mlずつストックチューブに分注し、液体窒素中に放り込む
↓完全に凍ったら液体窒素タンク中で保存する


PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）

疑問(´・ω・｀)
このタイトルはこれでいいんかな？

↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)


★XhoⅠばーじょん！
下記の組成に従って反応液を調整する
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置する

★Xba Ⅰ、Nhe Ⅰばーじょんです
下記の組成に従って反応液を調整する
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
API2-MALT1
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x L Buffer5 µl
Nhe Ⅰ1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置する

ligation


下記の組成に従って反応液を調整する
insert0.5 µl
vector0.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl

16°C、30minでincubateする

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