Team:KIT-Kyoto/nakagawa9月

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9/1
(目的)
ベクターのゲル抽出、GFP改良版のPCR
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 µl
提出用ベクターPsb1C3	50μl
Lording Dyi	7 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利なカミソリでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

GFPのフレームシフトが懸念されたのでその不安材料をのぞくために新たなプライマーを作成しPCRにかけた

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
GFP	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cycle
Anneling	48.5°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の組成に従って混ぜた
(結果)
ゲル抽出の時に現れたバンドがベクターが約2kbなのであるべき場所にあることが分かった
PCRに関しては翌日電気泳動で確認したところあるべきバンドが出ていたので成功しているといえた

9/2
(目的)
GFPのフェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理

フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
Pst1,Ecoli1	1 µl
	total 51 µl

37°Cで20時間静置した
(結果)
GFPはあるべき場所で出ていたしフェノクロ処理後のバンドも濃度としてははっきりしていたので充分採れていたのでよかった 9/3
(目的)
GFPのゲル抽出
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
GFP	50μl
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
9/5
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションとトラフォ
(方法)
昨日精製したGFPとベクターのライゲーションを行った。それぞれの濃度は19ng/μlと25ng/μlであった
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateしたBR> そしてライゲーションがすんだ菌液をプレートにコンピテントセルを加えて形質転換を行わせることにした

ライゲーション菌液のトランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した

(結果)
コロニーは全く生えていなかった。だが昨年度もライゲーションは成功確率が低いということでインサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを決行することに決めた

9/6
(目的)
二回目のGFPとベクターのライゲーション
(方法)
16°C、30minでincubateする
下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした
↓ただ今回は工夫点としてベクターとインサートの濃度比を1:9にしてみた
↓そして昨日と同様にトラフォを行うことにした

トランスフォーメーション
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加えた
↓氷上で15分間冷やした
↓43°Cで30秒間熱ショクを与えた
↓氷上で10分間冷やした
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養した
↓LB(+amp)プレートに塗った
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養した

(結果)
翌日4つのコロニーの生成を確認することができた、そのコロニーの数はライゲーションのコロニー数としてはおかしなものではないと聞いていたので期待が高まった。

9/7
(目的)
昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャーとMLFのPCRと制限酵素処理とベクターの植菌
(方法)
昨日のライゲーションで4つのコロニーができていたのでプレカルチャーを行うことにした

↓昨日増やした提出用ベクターとGFPのコロニーを取りだした
↓そこにコロニーのふたにマジックで印をつけて先を焦がしたつまようじでコロニーを突っついた
↓LB液体培地2mlとクローラムフェニコール2μlを合わせた容器につまようじを入れた
↓これを6本分行った
↓一晩振とう培養をした

それと同時進行で白血病の原因タンパクを作るとされているMLFをPCRで増やすことを行った PCR(MLF)

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
MLF	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cyle
Anneling	48.6°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

そしてその後にPCR産物を制限酵素処理することにした
制限酵素処理(MLF)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
Pst1,Ecoli1	1 µl
	total 51 µl

37°Cで20時間静置した
9/8 (目的)
MLFのゲル抽出、ライゲーションの相談、昨日のベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
MLFのゲル抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
MLF	50μl
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

提出用ベクターのアルカリミニプレップ

↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した
↓プレートからシングルコロニーを分離した
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心した
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養した

フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(提出用ベクター)
下記の組成に従って反応液を調整した
(1)

MilliQ	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 58 µl

37°Cで20時間静置した

(結果)
MLFのバンドは見えなかった。そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。

9/9
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
(方法)
まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。
インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題
そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか
制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか

そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した

↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた

↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
(結果) エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
よって再度プレカルチャーの方をあす以降進めていくことになった

9/12
(目的)
大腸菌のプレカルチャー、GFPのPCRのフェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日全ての素材を失ってしまったのでもう一度両方の素材を作り直すことにした

大腸菌をまずは殖菌することにした
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する

GFPの方ももう一度PCRからやり直すことにした

PCR

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
GFP	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cycle
Anneling	48.5°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

上記の組成に従って混ぜた
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
Pst1,Ecoli1	1 µl
	total 51 µl

(結果)
9/13
(目的)
二回目の大腸菌のプレカルチャー、GFPのゲル抽出
(方法)
昨日の大腸菌のプレカルチャーは菌液が増えなかったのでもう一度同じことをすることにした。

↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する

GFPのゲル抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 ml
GFP	50μl
Lording Dyi	7 ml

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

(結果)
9/14
(目的)
ベクターのアルカミニプレッツ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した
↓プレートからシングルコロニーを分離した
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心した
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養した

フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
Pst1,Ecoli1	1 µl
	total 51 µl

@@ Line 10: / Line 10: @@
 <tr><td><table border=1 width="230px">
-<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
+<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>提出用ベクターPsb1C3</td><td align=right>50μl</td></tr>
-<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 ml</td></tr>
+<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 µl</td></tr>
 </table>
@@ Line 20: / Line 20: @@
 ↓EtBrでゲルを40分間染色した<BR>
 ↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<BR>
-↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<BR>
+↓清潔で鋭利なカミソリでゲルからDNA断片を切りだした<BR>
 ↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<BR>
 ↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<BR>
@@ Line 49: / Line 49: @@
 <tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>GFP</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 71: / Line 71: @@
 </table>
 <BR>
-上記の組成に従って混ぜる<BR>
+上記の組成に従って混ぜた<BR>
 (結果)<BR>
 ゲル抽出の時に現れたバンドがベクターが約2kbなのであるべき場所にあることが分かった<BR>
@@ Line 97: / Line 97: @@
 制限酵素処理(GFP)<BR>
-下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
 <TABLE border="0"><TR><TD>
@@ Line 109: / Line 109: @@
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 51 µl</td></tr>
 </table>
-</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
-<table border="0">
-<tr><td>vector</td></tr>
-</table>
-<table border=1 width="250px">
-<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width"50px" align=right>10 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center><I>Pst1,Ecoli1</I></td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 51 µl</td></tr>
-</table>
-</TD></TR>
 </TABLE>
-°Cで20時間静置する
+°Cで20時間静置した
 <BR>
@@ Line 135: / Line 123: @@
 <a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<BR>
 ↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<BR>
-↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる<BR>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<BR>
 <tr><td><table border=1 width="230px">
@@ Line 179: / Line 167: @@
-下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
 <table border=1 width="200px">
@@ Line 192: / Line 180: @@
 <BR>
-°C、30minでincubateする<BR>
+°C、30minでincubateしたBR>
 そしてライゲーションがすんだ菌液をプレートにコンピテントセルを加えて形質転換を行わせることにした<BR>
@@ Line 215: / Line 203: @@
-下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
 <table border=1 width="200px">
@@ Line 228: / Line 216: @@
 <BR>
-°C、30minでincubateする<BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
 ↓ただ今回は工夫点としてベクターとインサートの濃度比を1:9にしてみた<BR>
@@ Line 266: / Line 254: @@
 <tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MLF</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 291: / Line 279: @@
 制限酵素処理(MLF)<BR>
-下記の組成に従って反応液を調整する<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
 <TABLE border="0"><TR><TD>
@@ Line 303: / Line 291: @@
 <tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 51 µl</td></tr>
 </table>
-</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
+</TABLE>
+°Cで20時間静置した
+<BR>
+/8
+(目的)<BR>
+MLFのゲル抽出、ライゲーションの相談、昨日のベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理<BR>
+(方法)<BR>
+MLFのゲル抽出<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した<BR>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<BR>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<BR>
+<tr><td><table border=1 width="230px">
+<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
+<tr><td align=center>MLF</td><td align=right>50μl</td></tr>
+<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 ml</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<BR>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<BR>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<BR>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<BR>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<BR>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<BR>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<BR>
+↓カラムにサンプルをのせた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<BR>
+↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓37 µlのMilliQを加えた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
+<BR>
+提出用ベクターのアルカリミニプレップ<BR>
+<BR>
+↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した<BR>
+↓プレートからシングルコロニーを分離した<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した<BR>
+↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした<BR>
+↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+↓氷上で5分間冷やした<BR>
+↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた、ボルテックスは使用しない<BR>
+↓氷上で5分間冷やした<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心した<BR>
+↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した<BR>
+↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた<BR>
+↓2分間室温で放置した<BR>
+↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした<BR>
+↓2分間室温で放置した<BR>
+↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓沈殿を10分～15分乾かした<BR>
+↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養した<BR>
+<BR>
+フェノクロ処理<BR>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<BR>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<BR>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<BR>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<BR>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<BR>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<BR>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<BR>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<BR>
+<BR>
+制限酵素処理(提出用ベクター)<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+(1)<br>
+<tr><td><table border=1 width="220px">
+<tr><td width="130px" align=center>MilliQ</td><td width="90px"  align=right>50 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>EcoR</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 58 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+°Cで20時間静置した<BR>
+<BR>
+(結果)<BR>
+MLFのバンドは見えなかった。そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。<BR>
+<BR>
+/9<BR>
+(目的)<BR>
+ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿<BR>
+(方法)<BR>
+まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。<BR>
+インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題<BR>
+そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか<BR>
+制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか<BR>
+<BR>
+そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した<BR>
+<BR>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<BR>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<BR>
+<BR>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<BR>
+(結果)
+エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。<BR>
+よって再度プレカルチャーの方をあす以降進めていくことになった<BR>
+<BR>
+/12<BR>
+(目的)<BR>
+大腸菌のプレカルチャー、GFPのPCRのフェノクロ処理、制限酵素処理<BR>
+(方法)<BR>
+昨日全ての素材を失ってしまったのでもう一度両方の素材を作り直すことにした<BR>
+<BR>
+大腸菌をまずは殖菌することにした<BR>
+↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する<BR>
+↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する<BR>
+<BR>
+GFPの方ももう一度PCRからやり直すことにした<BR>
+<BR>
+PCR
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150px">
+<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="220px">
+<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>GFP</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><TD></TD><TD></TD><td>
+<table border="0" width="100px">
+<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="400px">
+<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>95°C</td><td width="100px"  align=center>30sec</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
+<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>48.5°C</td><td align=center>1min</td></tr>
+<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
+<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+<BR>
+上記の組成に従って混ぜた<BR>
+制限酵素処理(GFP)<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
 <table border="0">
-<tr><td>vector</td></tr>
+<tr><td>cDNA</td></tr>
 </table>
-<table border=1 width="250px">
+<table border=1 width="200px">
-<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width"50px" align=right>10 µl</td></tr>
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center><I>Pst1,Ecoli1</I></td><td align=right>1 µl</td></tr>
@@ Line 317: / Line 477: @@
 </TABLE>
+(結果)<BR>
-°Cで20時間静置する
+/13<BR>
+(目的)<BR>
+二回目の大腸菌のプレカルチャー、GFPのゲル抽出<BR>
+(方法)<BR>
+昨日の大腸菌のプレカルチャーは菌液が増えなかったのでもう一度同じことをすることにした。<BR>
+<BR>
+↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する<BR>
+↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する<BR>
+<BR>
+GFPのゲル抽出<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した<BR>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<BR>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<BR>
+<tr><td><table border=1 width="230px">
+<tr><td width="130px" align=center>1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100px"  align=right>3 ml</td></tr>
+<tr><td align=center>GFP</td><td align=right>50μl</td></tr>
+<tr><td align=center>Lording Dyi</td><td align=right>7 ml</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<BR>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<BR>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<BR>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<BR>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<BR>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<BR>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<BR>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<BR>
+↓カラムにサンプルをのせた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<BR>
+↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<BR>
+↓37 µlのMilliQを加えた<BR>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<BR>
+↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
 <BR>
+(結果)<BR>
+/14<BR>
+(目的)<BR>
+ベクターのアルカミニプレッツ、フェノクロ処理、制限酵素処理<BR>
+(方法)<BR>
+↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した<BR>
+↓プレートからシングルコロニーを分離した<BR>
+↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した<BR>
+↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした<BR>
+↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
+↓氷上で5分間冷やした<BR>
+↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた、ボルテックスは使用しない<BR>
+↓氷上で5分間冷やした<BR>
+↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心した<BR>
+↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した<BR>
+↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた<BR>
+↓2分間室温で放置した<BR>
+↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした<BR>
+↓2分間室温で放置した<BR>
+↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた<BR>
+↓沈殿を10分～15分乾かした<BR>
+↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養した<BR>
+<BR>
+<BR>
+フェノクロ処理<BR>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<BR>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<BR>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<BR>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<BR>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<BR>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<BR>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<BR>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<BR>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<BR>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<BR>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<BR>
+<BR>
+制限酵素処理(GFP)<BR>
+下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+<TABLE border="0"><TR><TD>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><I>Pst1,Ecoli1</I></td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 51 µl</td></tr>
+</table>
+</TABLE>
 </body>
 </html>