Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 μl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbpマーカー	5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector	50 µl
Lording Dyi	10 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cyle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	100sec
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた

9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH₂O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 μlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 μl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土)
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/18(日)
横井川
LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した

ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/20（火）
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

ゲル抽出
【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

100bp マーカー	3 μl
MLF	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
濃度は70 ng/μlだった。

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

【結果】

9/21（水）
LBプレート作成

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製した
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

【結果】

9/22（木）
ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

9/23
ライゲーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション
【実験方法】

9/24
プレカルチャー
【目的】 pSB1C3の増殖
【実験方法】

9/25
濃度チェック
【目的】電気泳動によるGFPの濃度測定
【実験方法】

ライゲーション
【目的】 pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

9/26
ゲル抽出
【目的】 MLF,pSB1C3 vectorの精製
【実験方法】ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 μl
MLF or pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した

9/27
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理後のpSB1C3の精製
【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
サンプル①の濃度は30 ng/μl サンプル②の濃度は22 ng/μl サンプル③の濃度は26 ng/μl
サンプル④の濃度は24 ng/μl サンプル⑤の濃度は22 ng/μl サンプル⑥の濃度は29 ng/μl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした
↓

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーが見られなかった

9/28
制限酵素処理
【目的】
pSB1C3の調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。

MilliQ	6 µl
pSB1C3	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
GFPのコロニーが見られた

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 </head>
 <body>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">8/29(</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">月</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">)<o:p></o:P></span></p>
+<p>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田、横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
+/29(月)<BR>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">の制限酵素処理（一回目：</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">Xho I</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">）<br>
+<BR>
-</p>
+武田、横井川<BR>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【実験操作】<br>
+<BR>
-</span></span><strong>PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+制限酵素処理<br>
-</strong>↓PCR産物を400
+【目的】<BR>
-&micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：<i>Xho</i> I）<br>
-↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
+<BR>
-&micro;l加えてvoltexする<br>
+【実験操作】<br>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
-↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
-↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
-↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
-↓3M
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
-CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
-ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
-↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
-↓上澄みを捨て、70%
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
-ethanol(EtOH)を200
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
-&micro;l加える<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
-↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
-↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
-↓ddH<sub>2</sub>Oを44
+※保存する場合 ↓-20°Cで保存した<br>
-&micro;l加えてvoltexする<br>
-※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
 <br>
-</p>
+<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
-<p><strong>制限酵素処理(<i>Xho</i>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
-I)</strong><br>
-下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+°Cで20時間静置した
+<br>
+/30(火)<BR>
+武田、横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：<i>Xho</i> I)<br>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した <br>
+/31(水)<BR>
+武田、横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
+<BR>
+【実験操作】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbpマーカー</td><td width="100"  align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2 or PUAST-flag vector</td><td align="right">50 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 µl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 µlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。<BR>
+DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/1(木)<BR>
+武田<BR>
+<br>
+PCR<BR>
+【目的】<br>
+DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+下記の組成に従って試薬をまぜた<br>
+右に示したプログラムで反応を行った<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150">
+<tr><td align="center">PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="220">
+<tr><td width="150" align="center">10 µM Primer F</td><td width="70"  align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 µM Primer R</td><td align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Template DNA</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x PCR Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">dNTPs</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">MgSO<sub>4</sub></td><td align="right">2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0" width="100">
+<tr><td align="center">Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="400">
+        <tbody>
+<tr><td width="100" align="center">Pre-Denature</td><td width="100"  align="center">94°C</td><td width="100"  align="center">2min</td></td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align="center">Denature</td><td align="center">94°C</td><td align="center">15sec</td><td align="center" rowspan="3">35 Cyle</td></tr>
+<tr><td align="center">Anneling</td><td align="center">50.5°C</td><td align="center">30sec</td></tr>
+<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
+<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+</table></td></tr></tbody></table>
+<BR>
+<BR>
+【目的】<BR>
+PCR産物の確認<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+<strong>ゲル電気泳動</strong></p><BR>
+ゲル1枚当たりの組成
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
+<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+【結果】<br>
+正しい位置にバンドが確認できた
+<br>
+<BR>
+<BR>
+/5(月)<BR>
+横井川<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<BR>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(<i>Xho</i> I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 <table border="0"><tr><td>
@@ Line 62: / Line 282: @@
 </td></tr>
 </table>
-°Cで20時間静置する
+°Cで20時間静置した
+<br></p>
+</body>
+/6(火)<BR>
+横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+</strong>↓PCR産物を400 μlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 μl加えてvoltexした<br>
+ <br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>
+°Cで20時間静置した
-<br></p>
-</body>
-<head>
-<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
-<title></title>
-</head>
-<body>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">8/30(</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">火</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US">)<o:p></o:P></span></p>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">武田、横井川</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt" lang="EN-US"><o:p></o:P></span></p>
-<p style="TEXT-ALIGN: left; MARGIN: 0mm 0mm 0pt; mso-pagination: widow-orphan" class="MsoNormal" align="left"><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br>
-</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">産物と</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">pUAST-flag vector</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">の制限酵素処理</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">(</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">二回目：</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">Xba I)<br>
-<span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br>
-<strong>PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
-</strong>↓PCR産物を400
-&micro;lまでddH<sub>2</sub>Oで薄める<br>
-↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
-&micro;l加えてvoltexする<br>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br>
-↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
-↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする<br>
-↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する<br>
-↓水層のみを新しいチューブに移す<br>
-↓3M
-CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
-ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する<br>
-↓15000rpm、4°Cで10min遠心する<br>
-↓上澄みを捨て、70%
-ethanol(EtOH)を200
-&micro;l加える<br>
-↓15000rpm、4°Cで5min遠心する<br>
-↓上澄みを捨て、乾燥させる<br>
-↓ddH<sub>2</sub>Oを44
-&micro;l加えてvoltexする<br>
-※保存する場合 ↓-20°Cで保存する <br>
 <br>
-<strong>制限酵素処理(Xba
+<BR>
-I)</strong></span></span></p><br>
+/7(水)<BR>
+横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出<BR>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
-下記の組成に従って反応液を調整する<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/17（土)<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 <table border="0"><tr><td>
@@ Line 119: / Line 387: @@
 <tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
 <tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した
+<br>
+<BR>
+/18(日)<BR>
+横井川<BR>
+LB培地<BR>
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">bacto tryptone</td><td width="50" align="right">10 g</td></tr>
+<tr><td align="center">bacto yeast evtract</td><td align="right">5 g</td></tr>
+<tr><td align="center">NaCl</td><td align="right">10 g</td></tr>
 </table>
+<br>
+↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた<br>
+↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした<br>
+↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした<br>
+↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した<br>
-<tr><td>vector</td></tr>
+<br><br><br>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製<BR>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br></p>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/20（火）<br>
+【目的】<BR>
+DIAP2のPCR産物の確認<br>
+<BR>
+【実験操作】<BR>
+ゲル電気泳動<BR>
+<BR>
+ゲル1枚当たりの組成
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
+<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+<br>
+<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<br>
+MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製<br>
+<BR>
+【実験方法】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+MLF</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 </table>
-<table border="1" width="250">
-<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/μl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 μl</td></tr>
-<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
-<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
-</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する <br>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
+<BR>
+【結果】<br>
+濃度は70 ng/μlだった。<br>
+<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓90 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+【結果】<br>
+<br>
+<br>
+<br>
+/21（水）<br>
+LBプレート作成<BR>
+</p><table border="1" width="170">
+<tr><td width="100" align="center">LB培地</td><td width="70" align="right">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align="center">bacto-agar</td><td align="right">15 g/l</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓LB培地を作製した<br>
+↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した<br>
+↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した<br>
+↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた<br>
+↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した<br>
+↓水平な所に置いて固まらせた<br>
+<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
+<br>【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
+<br>
+【結果】<br>
+<br>
+/22（木）<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
+<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
+<br>
+<br>
+/23<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+MLFおよびGFPのライゲーション<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+<br>
+/24<br>
+プレカルチャー<br>
+【目的】
+pSB1C3の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+<br>
+/25<br>
+濃度チェック<br>
+【目的】
+電気泳動によるGFPの濃度測定<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+/26<br>
+ゲル抽出<br>
+【目的】
+MLF,pSB1C3 vectorの精製<br>
+【実験方法】
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+MLF or pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+<br>
+/27<br>
+ゲル抽出<BR>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理後のpSB1C3の精製<BR>
+【実験方法】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
+【結果】<BR>
+サンプル①の濃度は30 ng/μl  サンプル②の濃度は22 ng/μl  サンプル③の濃度は26 ng/μl<BR>
+サンプル④の濃度は24 ng/μl  サンプル⑤の濃度は22 ng/μl  サンプル⑥の濃度は29 ng/μl<BR>
+<BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
+【実験方法】<BR>
+↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした<BR>
+↓
+<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<BR>
+【目的】<BR>
+MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<BR>
+【実験方法】<BR>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+コロニーが見られなかった<BR>
+<BR>
+/28<BR>
+制限酵素処理<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3の調整<BR>
+【実験方法】<BR>
+下表に従って、制限酵素処理を行った。<BR>
+<BR>
+<tr><td><table border=1 width="220px">
+<tr><td width="130px" align=center>MilliQ</td><td width="90px"  align=right>6 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>pSB1C3</td><td align=right>20 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Xba</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 30 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+<BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
+【実験方法】<BR>
+vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
+</table>
+<BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+GFPのコロニーが見られた
+<BR>
+</p>
 </body>
 </html>