Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 µl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/µl)	10 μl
ddH₂O	34 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbpマーカー	5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector	50 µl
Lording Dyi	10 µl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。

9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer	5 µl
dNTPs	5 µl
MgSO₄	2 µl or 4 µl
ddH₂O	33 µl or 31 µl
KOD⁺ polymelase	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	94°C	2min
Denature	94°C	15sec	35 Cyle
Anneling	50.5°C	30sec
Extension	68°C	100sec
End	4°C	keep

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた

9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH₂O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 μlまでddH₂Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH₂Oを44 μl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/17（土)
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した

DIAP2

PCR産物 in ddH₂O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

9/18(日)
横井川
LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した

ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
DIAP2	50 μl
Lording Dyi	10 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

9/20（火）
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.2 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

ゲル抽出
【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

100bp マーカー	3 μl
MLF	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
濃度は70 ng/μlだった。

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

【結果】

9/21（水）
LBプレート作成

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製した
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

【結果】

9/22（木）
ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

9/23
ライゲーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション
【実験方法】

9/24
プレカルチャー
【目的】 pSB1C3の増殖
【実験方法】

9/25
濃度チェック
【目的】電気泳動によるGFPの濃度測定
【実験方法】

ライゲーション
【目的】 pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

9/26
ゲル抽出
【目的】 MLF,pSB1C3 vectorの精製
【実験方法】ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp or 100bp マーカー	3 μl
MLF or pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した

9/27
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理後のpSB1C3の精製
【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた

1 kbp マーカー	3 μl
pSB1C3	50 μl
Lording Dyi	7 μl

↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
サンプル①の濃度は30 ng/μl サンプル②の濃度は22 ng/μl サンプル③の濃度は26 ng/μl
サンプル④の濃度は24 ng/μl サンプル⑤の濃度は22 ng/μl サンプル⑥の濃度は29 ng/μl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした
↓

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーが見られなかった

9/28
制限酵素処理
【目的】
pSB1C3の調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。

MilliQ	6 µl
pSB1C3	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
GFPのコロニーが見られた

@@ Line 1: / Line 1: @@
+<html>
+<head>
+<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
+<title></title>
+</head>
+<body>
+<p>
+/29(月)<BR>
+<BR>
+武田、横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<BR>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：<i>Xho</i> I）<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+※保存する場合 ↓-20°Cで保存した<br>
+<br>
+<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+°Cで20時間静置した
+<br>
+/30(火)<BR>
+武田、横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（二回目：<i>Xho</i> I)<br>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した <br>
+/31(水)<BR>
+武田、横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
+<BR>
+【実験操作】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbpマーカー</td><td width="100"  align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2 or PUAST-flag vector</td><td align="right">50 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 µl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 µlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。<BR>
+DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/1(木)<BR>
+武田<BR>
+<br>
+PCR<BR>
+【目的】<br>
+DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+下記の組成に従って試薬をまぜた<br>
+右に示したプログラムで反応を行った<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0" width="150">
+<tr><td align="center">PCR条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="220">
+<tr><td width="150" align="center">10 µM Primer F</td><td width="70"  align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 µM Primer R</td><td align="right">1.5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">Template DNA</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x PCR Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">dNTPs</td><td align="right">5 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">MgSO<sub>4</sub></td><td align="right">2 µl or 4 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">33 µl or 31 µl</td></tr>
+<tr><td align="center">KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align="right">1 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0" width="100">
+<tr><td align="center">Cycle条件</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="400">
+        <tbody>
+<tr><td width="100" align="center">Pre-Denature</td><td width="100"  align="center">94°C</td><td width="100"  align="center">2min</td></td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align="center">Denature</td><td align="center">94°C</td><td align="center">15sec</td><td align="center" rowspan="3">35 Cyle</td></tr>
+<tr><td align="center">Anneling</td><td align="center">50.5°C</td><td align="center">30sec</td></tr>
+<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
+<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
+</table></td></tr></tbody></table>
+<BR>
+<BR>
+【目的】<BR>
+PCR産物の確認<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+<strong>ゲル電気泳動</strong></p><BR>
+ゲル1枚当たりの組成
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
+<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+【結果】<br>
+正しい位置にバンドが確認できた
+<br>
+<BR>
+<BR>
+/5(月)<BR>
+横井川<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<BR>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理（一回目：Xho I）<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(<i>Xho</i> I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>cDNA</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table>
+</td><td></td><td></td><td>
+<table border="0">
+<tr><td>vector</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="250">
+<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/μl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table>
+</td></tr>
+</table>
+°Cで20時間静置した
+<br></p>
+</body>
+/6(火)<BR>
+横井川<BR>
+<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
+</strong>↓PCR産物を400 μlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
+↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
+↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した<br>
+↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
+↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した<br>
+↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
+↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
+↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
+↓ddH<sub>2</sub>Oを44 μl加えてvoltexした<br>
+ <br>
+<br>
+<BR>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>
+°Cで20時間静置した
+<br>
+<BR>
+/7(水)<BR>
+横井川<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出<BR>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/17（土)<BR>
+制限酵素処理<br>
+【目的】<br>
+DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)<br>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+制限酵素処理(Xba I)<br>
+下記の組成に従って反応液を調整した<br>
+<table border="0"><tr><td>
+<table border="0">
+<tr><td>DIAP2</td></tr>
+</table>
+<table border="1" width="200">
+<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
+<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
+</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した
+<br>
+<BR>
+/18(日)<BR>
+横井川<BR>
+LB培地<BR>
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">bacto tryptone</td><td width="50" align="right">10 g</td></tr>
+<tr><td align="center">bacto yeast evtract</td><td align="right">5 g</td></tr>
+<tr><td align="center">NaCl</td><td align="right">10 g</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた<br>
+↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした<br>
+↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした<br>
+↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した<br>
+<br><br><br>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製<BR>
+<BR>
+【実験操作】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<BR>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br></p>
+<BR>
+<BR>
+【結果】<BR>
+バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
+<BR>
+<BR>
+<BR>
+/20（火）<br>
+【目的】<BR>
+DIAP2のPCR産物の確認<br>
+<BR>
+【実験操作】<BR>
+ゲル電気泳動<BR>
+<BR>
+ゲル1枚当たりの組成
+<tr><td><table border="1" width="200">
+<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
+<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
+↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
+↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
+↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
+↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
+↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+<br>
+<BR>
+ゲル抽出<br>
+【目的】<br>
+MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製<br>
+<BR>
+【実験方法】<br>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+MLF</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
+<BR>
+【結果】<br>
+濃度は70 ng/μlだった。<br>
+<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓90 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+【結果】<br>
+<br>
+<br>
+<br>
+/21（水）<br>
+LBプレート作成<BR>
+</p><table border="1" width="170">
+<tr><td width="100" align="center">LB培地</td><td width="70" align="right">&nbsp;</td></tr>
+<tr><td align="center">bacto-agar</td><td align="right">15 g/l</td></tr>
+</table>
+<br>
+↓LB培地を作製した<br>
+↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した<br>
+↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した<br>
+↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた<br>
+↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注した<br>
+↓水平な所に置いて固まらせた<br>
+<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
+<br>【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
+<br>
+【結果】<br>
+<br>
+/22（木）<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
+<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
+<br>
+<br>
+/23<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】<br>
+MLFおよびGFPのライゲーション<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+<br>
+/24<br>
+プレカルチャー<br>
+【目的】
+pSB1C3の増殖<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+<br>
+/25<br>
+濃度チェック<br>
+【目的】
+電気泳動によるGFPの濃度測定<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+ライゲーション<br>
+【目的】
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
+【実験方法】<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+<br>
+/26<br>
+ゲル抽出<br>
+【目的】
+MLF,pSB1C3 vectorの精製<br>
+【実験方法】
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+MLF or pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+<br>
+/27<br>
+ゲル抽出<BR>
+【目的】<BR>
+制限酵素処理後のpSB1C3の精製<BR>
+【実験方法】<BR>
+ゲルからのDNA抽出<br>
+<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
+↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
+<tr><td><table border="1" width="230">
+<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">
+pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
+<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
+</table>
+↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
+↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
+↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
+↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
+↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
+↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
+↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
+↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
+↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
+↓カラムにサンプルをのせた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
+↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
+↓37 μlのMilliQを加えた<br>
+↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
+↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
+【結果】<BR>
+サンプル①の濃度は30 ng/μl  サンプル②の濃度は22 ng/μl  サンプル③の濃度は26 ng/μl<BR>
+サンプル④の濃度は24 ng/μl  サンプル⑤の濃度は22 ng/μl  サンプル⑥の濃度は29 ng/μl<BR>
+<BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
+【実験方法】<BR>
+↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした<BR>
+↓
+<br>
+<br>
+トランスフォーメーション<BR>
+【目的】<BR>
+MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<BR>
+【実験方法】<BR>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+コロニーが見られなかった<BR>
+<BR>
+/28<BR>
+制限酵素処理<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3の調整<BR>
+【実験方法】<BR>
+下表に従って、制限酵素処理を行った。<BR>
+<BR>
+<tr><td><table border=1 width="220px">
+<tr><td width="130px" align=center>MilliQ</td><td width="90px"  align=right>6 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>pSB1C3</td><td align=right>20 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Xba</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>3 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 30 µl</td></tr>
+</table>
+<br>
+<BR>
+ライゲーション<BR>
+【目的】<BR>
+pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
+【実験方法】<BR>
+vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
+<table border=1 width="200px">
+<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
+</table>
+<BR>
+°C、30minでincubateした<BR>
+<br>
+トランスフォーメーション<br>
+【目的】<br>
+pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
+【実験方法】<br>
+トランスフォーメーション<br>
+↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
+↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
+↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
+↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
+↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
+↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
+↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
+↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
+↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
+【結果】<BR>
+GFPのコロニーが見られた
+<BR>
+</p>
+</body>
+</html>