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Team:KIT-Kyoto/nakagawa9月
From 2011.igem.org
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制限酵素処理(GFP)<BR> | 制限酵素処理(GFP)<BR> | ||
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| + | 下記の組成に従って反応液を調整する<BR> | ||
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| + | <tr><td>cDNA</td></tr> | ||
| + | </table> | ||
| + | <table border=1 width="200px"> | ||
| + | <tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td> </td><td align=right>total 50 µl</td></tr> | ||
| + | </table> | ||
| + | </TD><TD></TD><TD></TD><TD> | ||
| + | <table border="0"> | ||
| + | <tr><td>vector</td></tr> | ||
| + | </table> | ||
| + | <table border=1 width="250px"> | ||
| + | <tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width"50px" align=right>10 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr> | ||
| + | <tr><td> </td><td align=right>total 50 µl</td></tr> | ||
| + | </table> | ||
| + | </TD></TR> | ||
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| + | 37°Cで20時間静置する | ||
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Revision as of 02:34, 28 September 2011
9/1
(目的)
ベクターのゲル抽出、GFP改良版のPCR
(方法)
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| ★DNAサンプル入力 | ★入力 |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| ★DNAサンプル入力 | ★入力 |
| Lording Dyi | 7 ml |
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
GFPのフレームシフトが懸念されたのでその不安材料をのぞくために新たなプライマーを作成しPCRにかけた
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上記の組成に従って混ぜる
(結果)
ゲル抽出の時に現れたバンドがベクターが約2kbなのであるべき場所にあることが分かった
PCRに関しては翌日電気泳動で確認したところあるべきバンドが出ていたので成功しているといえた
9/2
(目的)
GFPのフェノクロ処理、電気泳動、制限酵素処理
フェノクロ処理
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
制限酵素処理(GFP)
下記の組成に従って反応液を調整する
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