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Team:KIT-Kyoto/matsunami
From 2011.igem.org
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Tm値 56.5゜C<br> | Tm値 56.5゜C<br> | ||
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【目的】<br> | 【目的】<br> | ||
PCR産物の確認<br> | PCR産物の確認<br> | ||
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。<br> | |
| - | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 | + | |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | ||
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【目的】<br> | 【目的】<br> | ||
pUAST溶液の形質転換<br> | pUAST溶液の形質転換<br> | ||
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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pUAST 1 µLとコンピテントセルを混合した。<br> | pUAST 1 µLとコンピテントセルを混合した。<br> | ||
↓これを氷上で15分間放置した。<br> | ↓これを氷上で15分間放置した。<br> | ||
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 | ||
V、30分の条件で電気泳動した。<br> | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | ||
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
PCR反応液 | PCR反応液 | ||
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| - | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | 8 | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
| - | + | <table border="1" width="200px"> | |
| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
| - | + | <table border="1" width="200px"> | |
| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
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| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
| - | + | <table border="1" width="200px"> | |
| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
| - | + | <table border="1" width="200px"> | |
| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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【実験操作】<br> | 【実験操作】<br> | ||
| - | + | <table border="1" width="200px"> | |
| - | 2 | + | <tr><td width="140px" align=center>PCR反応液</td><td width="60px" align=right>2 µl</td></tr> |
| - | + | <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>8 µl</td></tr> | |
| - | + | <tr><td align=center>6 x loading dye</td><td align=right>2 µl</td></tr> | |
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| - | + | 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。<br> | |
| - | + | 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br> | |
| - | V、30分の条件で電気泳動した。<br> | + | |
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Revision as of 05:33, 26 September 2011
8月8日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
＊DIAP2
|
|
＊API2-MALT1
|
|
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4゜C
増幅サイズ 約1514 bp
・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値 57.8゜C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5゜C
増幅サイズ 約3131 bp
8月9日（火）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
pUAST 1 µLとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15分間放置した。
↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。
これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。
8月10日（水）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
8月8日と同様である。
【目的】
大腸菌の培養
【実験操作】
ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2mLに攪拌した。
pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µL、100 µLをそれぞれまいた。
8月11日（木）
松浪
【目的】
pUAST flag vectorの大量精製
【実験操作】
培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓5分後、上清を廃棄しglucose solution 100 µL加えて攪拌した。
↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。
↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。
↓遠心後、上清を廃棄し70% EtOH 200 µLを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。
遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µLを加えた。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月12日（金）
松浪、横井川
【目的】
pUAST flag vectorの大量精製
【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。
↓5分後、N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓70% EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µLでのTEに溶かした。
次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
| 0.189 | 0.208 | 0.192 | 0.190 | 0.191 |
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µLであった。
サンプル5
| 0.282 | 0.276 | 0.278 | 0.269 | 0.269 |
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µLであった。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月15日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 56.9℃
API2-MALT1 53℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月16日（火）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 58.9℃
API2-MALT1 53℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月17日（水）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 50.5℃
API2-MALT1 53.5℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
８/23(火)
松浪
【目的】
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
KOD+ polymelase 1
µL
10 x
Buffer
2 µL
dNTP(2.0
µM) 5
µL
F primer(10
µM)
1.5 µL
R primer(10
µM)
1.5
µL
Templet
DNA
1 µL
milliQ 33
µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94
℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃
15
sec
・DIAP2
Annealing 50.5 ℃ 30
sec
Extension 68
℃ 1 min 40
sec
・API2-MALT1
Annealing ℃
30
sec
Extension 68
℃ 3
min
<3>
72℃ 10 min
<4> 4℃
∞
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月24日（水）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月25日（木）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
・API2-MALT1
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
・DIAP2
（1）PCR反応液の調製()
<1本分あたり>
KOD+ polymelase 1 µL
10 x Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 5 µL
F primer(10 µM) 1.5 µL
R primer(10 µM) 1.5 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 33 µL
上記の分量を混合した。
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 50.5 ℃ 30 sec
Extension 68 ℃ 1 min 40 sec
<3> 4℃ ∞
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月12日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
KOD+ polymelase
1
µL
10 x
Buffer
2 µL
dNTP(2.0
µM) 5 µL
F
primer(10
µM)
1.5 µL
R primer(10
µM)
1.5
µL
Templet
DNA
1 µL
milliQ 33
µL
上記の分量を混合した。
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F
primer :
Tm値
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT 62 ℃
R primer
:
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
66.4 ℃
増幅サイズ 約1514
bp
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94
℃ 2 min
<2>×35 Denature 94 ℃
15
sec
Annealing 50.5 ℃ 30
sec
Extension 68
℃ 1 min 40
sec
<3>
4℃
∞
上記の条件でPCRを行った。
9月13日（火）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月14日（水）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1 µL
10 x Ex Taq Buffer 2 µL
dNTP(2.0 µM) 2 µL
F primer 0.4 µL
R primer 0.4 µL
Templet DNA 1 µL
milliQ 14.1 µL
上記の分量を混合した。
＊<プライマーの塩基配列>
・API2-MALT1
F primer : Tm値
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT 57.8 ℃
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA 56.5 ℃
増幅サイズ 約3131 bp
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature 94 ℃ 2 min
<2>×37 Denature 94 ℃ 15 sec
Annealing 51.5 ℃ 30 sec
Extension 72 ℃ 3 min 20 sec
上記の条件でPCRを行った。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
9月15日（木）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
|
|
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer : Tm値
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT 62 ℃
R primer :
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA 66.4 ℃
増幅サイズ 約1514 bp
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
| PCR反応液 | 2 µl |
| ddH2O | 8 µl |
| 6 x loading dye | 2 µl |
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
【目的】
PCR産物の制限酵素処理
【実験操作】
(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
↓3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
↓乾燥後、milliQ44 µLを加えて攪拌した。
この溶液にXhoIを1 µL、10×H Bufferを5 µLを加え、37℃で20時間静置した。
9月16日（金）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の制限酵素処理
【実験操作】
(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
↓3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
乾燥後、TE44 µLを加えて攪拌し-20℃で保存した。
