Team:KIT-Kyoto/matsunami

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8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
＊DIAP2

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
鋳型 DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
dNTPs(2.0 µM)	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
	全量 20 µl

Cycle条件

Start	94°C、2分
Cycle x 30	94°C、15秒(熱変性)
	56.9°C、30秒(アニーリング)
	72°C、100秒(伸長)
End	4°Cで保持

＊API2-MALT1

PCR条件

10 µM Primer F	0.4 µl
10 µM Primer R	0.4 µl
鋳型 DNA	1 µl
10 x Ex Taq Buffer	2 µl
dNTPs(2.0 µM)	2 µl
ddH₂O	14.1 µl
Takara Ex Taq	0.1 µl
	全量 20 µl

Cycle条件

Start	94°C、2分
Cycle x 30	94°C、15秒(熱変性)
	51.5°C、30秒(アニーリング)
	72°C、3分20秒(伸長)
End	4°Cで保持

上記の分量を混合した。

＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4゜C
増幅サイズ　　約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値　57.8゜C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5゜C
増幅サイズ　　約3131 bp

8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液 2 µl
milliQ 8 µl
6 x loading dye 2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

【目的】
　pUAST溶液の形質転換

【実験操作】
　pUAST　1 µLとコンピテントセルを混合した。
　↓これを氷上で15分間放置した。
　↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。
　これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。

8月10日（水）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　8月8日と同様である。

【目的】
　大腸菌の培養

【実験操作】
　ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
　↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2mLに攪拌した。
　pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µL、100 µLをそれぞれまいた。

8月11日（木）

松浪

【目的】
　pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
　培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
　↓5分後、上清を廃棄しglucose solution　100 µL加えて攪拌した。
　↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
　↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
　↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。
　↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。
　↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。
　↓遠心後、上清を廃棄し70% EtOH 200 µLを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。
　遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µLを加えた。
　
【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
　pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
　培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
　↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。
　↓5分後、N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
　↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
　↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
　↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。
　Air-dryで乾燥させ200 µLでのTEに溶かした。

　次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
　milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
　↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
　　　　　　　　　　　　　　　　表1、サンプル1、5の吸光度の値
　
　サンプル1

　0.189

　0.208

0.192　

0.190　

0.191　

平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µLであった。

サンプル5

　0.282

0.276　

0.278　

0.269　

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µLであった。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2   　　　  　　　　 56.9℃
　API2-MALT1 　　　　　53℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月16日（火）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2    　　　  　　　　　　 58.9℃
　API2-MALT1        　　　　　53℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月17日（水）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2　　　　  　　　　　　 50.5℃
　API2-MALT1　　　　　　　 53.5℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

　

　　　

８/23(火)

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　　 1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL

       上記の分量を混合した。
　　　
　　　           　　　

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
　　　　　　　　　　
　　　　　　　・DIAP2
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec
               ・API2-MALT1
　　　　　　　　　　 Annealing              ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       3 min

       <3>                                   72℃　　　　10 min
       <4>                                     4℃        ∞


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月24日（水）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL

       上記の分量を混合した。
　　　ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min 20 sec

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月25日（木）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　・API2-MALT1
（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL

       上記の分量を混合した。
　　　
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min 20 sec

    ・DIAP2
　（1）PCR反応液の調製()
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　　 1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL

       上記の分量を混合した。
　　　           　　　

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月12日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　　 1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL

       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞


        上記の条件でPCRを行った。

9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL

       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　・API2-MALT1
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT            57.8 ℃
              R primer
                 GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA              56.5 ℃
              増幅サイズ　　約3131 bp
　　　

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
            　         Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min 20 sec

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　　 1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL

       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　

　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature 　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　 15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
milliQ                    8 µL
6 x loading dye       2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。

【目的】
　PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　↓乾燥後、milliQ44 µLを加えて攪拌した。
　　　この溶液にXhoIを1 µL、10×H Bufferを5 µLを加え、37℃で20時間静置した。

9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　乾燥後、TE44 µLを加えて攪拌し-20℃で保存した。

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