Une course entre deux stratégies différentes afin d'obtenir la première part

Chez E. coli le système de production de curli est organisé en deux opérons divergents avec les gènes csgA, csgB et csgC d'un côté et csgD, csgE, csgF et csgG de l'autre. La propriété recherchée, l'adhésion par l'intermédiaire de curli, peut être réalisée par l'intermédiaire de deux voies différentes: la création d'une voie de synthèse indépendante de curlis (première option), ou en activant la voie de synthèse des curlis existante présente dans la plupart des souches de laboratoire E. coli (deuxième en option).

Pour atteindre la première option consistant en la création d'un seul opéron curli indépendante, nous avons essayé deux méthodes en parallèle: une approche complètement synthétique, et une méthode classique impliquant une étape de mutagenèse afin de se débarrasser de trois sites de restriction internes à la part et non conformes au règlement iGEM, suivie d'une étapes de PCR puis de ligations.

• La première approche consiste à commander toute la part à une entreprise privée (GeneCust).


• La seconde approche consiste à faire directement la synthèse sur paillace, cette approche comporte trois étapes: premièrement une amplification par PCR de chacune des sous-parts, puis une étape de mutagenèse pour supprimer tous les sites naturels EcoRI ou Pst1 présents dans les sous-parts, et enfin une étape de ligation de ces parts.

Les deux approches ont été initiées en même temps. La seconde nous a permis d'obtenir une amplifications par PCR de taille correcte et une construction complète de Prcn-csgBAEFG, malheureusement l'analyse du séquençage a révélé des mutations inattendues qui n'ont pas été enlevées avant la réception de l'ensemble de la part synthétisée par GeneCust. En bref, la stratégie "clic et commande" a gagné la course!

Amélioration de la Souche

Rendre notre souche auxotrophe

Afin d'éviter la dispersion des souches et les problèmes que les OGM peuvent engendrer, nous visons à rendre notre souche dépendante de certaines conditions de culture. Nous avons décidé de rendre notre souche auxotrophe, c'est à dire déléter un gène de biosynthèse d'un acide aminé. Grâce à un "knock out", la souche aurait besoin d'un milieu de culture contenant l'acide aminé manquant et mourrait en l'absence de ce dernier.
En pratique, nous aurions utilisé le kit "Quick & Easy E.coli Gene Deletion Kit". Nous aurions conçu une séquence avec un gène de résistance aux antibiotiques tels que la Tétracycline, certains accessoires fournis par le kit et une séquence homologue du gène que nous voulons inactiver. Par recombinaison homologue, la séquence entière aurait été insérée dans le gène. Enfin par excision, la résistance pourrait être enlevée afin d'éviter des problèmes éthiques.
Ces modifications auraient nécessité plusieurs semaines de travail, elles restent donc à l'état de projet pour le moment.

Insertion d'un transporteur de gène directement dans le gène de la pompe d'efflux

Nous pourrions avoir deux problèmes avec notre souche:

• Les caractéristiques du transporteur sont situés sur un plasmide qui pourrait ne pas être stable


• Il y a un gène de résistance à la kanamycine dans le chromosome (inactivant le gène de la pompe d'efflux).

Une seule solution unique à ces deux problèmes: il faudrait insérer les fonctionnalités du transporteur dans le gène de la pompe d'efflux.
Nous utiliserions le même Kit que précédemment mentionné, mais nous n’utiliserions pas un gène de résistance à un antibiotique, que nous retirerions après coup, mais directement le gène du transporteur NiCoT. Les souches répondant au cobalt (Co) seraient alors sélectionnées.