Une course entre deux stratégies différentes a été utilisé afin d'obtenir la première part

Chez E. coli le système de production de curli est organisé en deux opérons divergents avec les gènes csgA, csgB et csgC d'un côté et csgD, csgE, csgF et csgG de l'autre. La propriété recherchée, l'adhésion par l'intermédiaire de curli, peut être réalisée par l'intermédiaire de deux voies différentes: la création d'une voie de synthèse indépendante de curlis (première option), ou en activant la voie de synthèse des curlis existante présente dans la plupart des souches de laboratoire E. coli (deuxième en option).

Pour atteindre la première option consistant en la création d'un seul opéron curli indépendante, nous avons essayé deux méthodes en parallèle: une approche complètement synthétique, et une méthode classique impliquant une étape de mutagenèse afin de se débarrasser de trois sites de restriction internes à la part et non conformes au règlement iGEM, suivie d'une étapes de PCR puis de ligations.

• La première approche consiste à commander toute la part à une entreprise privée (GeneCust).


• La seconde approche consiste à faire directement la synthèse sur paillace, cette approche comporte trois étapes: premièrement une amplification par PCR de chacune des sous-parts, puis une étape de mutagenèse pour supprimer tous les sites naturels EcoRI ou Pst1 présents dans les sous-parts, et enfin une étape de ligation de ces parts.

Les deux approches ont été initiées en même temps. La seconde nous a permis d'obtenir une amplifications par PCR de taille correcte et une construction complète de Prcn-csgBAEFG, malheureusement l'analyse du séquençage a révélé des mutations inattendues qui n'ont pas été enlevées avant la réception de l'ensemble de la part synthétisée par GeneCust. En bref, la stratégie "clic et commande" a gagné la course!