Une course entre deux stratégies différentes a été utilisé afin d'obtenir la première part

Chez E. coli le système de production de curli est organisé en deux opérons divergeant avec les gènes csgA, csgB et csgC d'un côté et csgD, csgE, csgF et csgG de l'autre. Donc, pour atteindre la première approche du projet, il est nécessaire de commencer par la création de trois " sous-parties ": la première serait la partie avec le promoteur exclusif PrcnA, la seconde serait le partie avec les gènes csgA et csgB et la dernière serait la partie avec les gènes csgE, csgF et csgG.

La synthèse de cette première part d'ADN (le promoteur Prcn-csgBAEFG inductible par le cobalt, conçu pour induire la formation de biofilm et à promouvoir l'adhésion cellulaire) a été conçu en mettant en concurrence les deux méthodes: une approche complètement synthétique, et une méthode "manuel" impliquant des étapes de PCR suivie par des ligations.

• La première approche consiste à commander toute la partie à une entreprise privée (GeneCust).


• La seconde approche consiste à faire directement la synthése sur paillace, cette approche comporte trois étapes: d'abord l'amplification par PCR de chacune des sous-parts, suivie d'une étape de mutagenèse pour supprimer tous les sites naturels EcoRI internes situés dans les sous-parts, et enfin une étape de ligation de ces parts.

Les deux approaches ont été initiées dans le même temps, et même si la seconde nous a permis d'obtenir une amplifications par PCR de taille correcte (voir figure) et une construction complète de Prcn-csgBAEFG, malheureusement l'analyse du séquençage a révélé des mutations inattendues qui n'ont pas été enlevé avant la réception de l'ensemble de la part faite par GeneCust. En bref, la stratégie "clic et commande" a gagné la course!

Amplification par PCR des sous-parts : csgEFG 1.8kb (lane 1), csgBA 1kb (lane 3) et Prcn 0.5kb (lane 5) et contrôle négative de PCR (lanes 2, 4 and 6)