Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

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<p><strong>コンピテント細胞の作製</strong></p>
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SOB培地(1 L)
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<tr><td><table border=1 width="150px">
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<tr><td width="100px" align=center>bacto tryptone</td><td width="50px" align=right>20 g</td></tr>
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<tr><td align=center>bacto yeast extract</td><td align=right>5 g</td></tr>
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<tr><td align=center>5M NaCl</td><td align=right>2 mL</td></tr>
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<tr><td align=center>2K KCl</td><td align=right>1.25 mL</td></tr>
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</table>
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↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる<BR>
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↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する<BR>
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Transformation Buffer(TB)
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<tr><td><table border=1 width="150px">
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<tr><td width="100px" align=center>PIPES</td><td width="50px" align=right>1.5 g</td></tr>
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<tr><td align=center>CaCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.1 g</td></tr>
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<tr><td align=center>KCl</td><td align=right>9.3 g</td></tr>
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</table>
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↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH<sub>2</sub>O 400 mlに溶解する<BR>
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↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる<BR>
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↓MnCl<sub>2</sub>H<sub>2</sub>Oを5.45 g添加する<BR>
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↓ddH<sub>2</sub>Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する<BR>
</body>
</body>
</html>
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Revision as of 15:20, 20 September 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone10 g
bacto yeast evtract5 g
NaCl10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌する



LBプレート

LB培地 
bacto-agar15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる



トランスフォーメーション


去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37°Cで一晩培養する


今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43°Cで30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37°C(API2-MALT1は30°C)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37°C(API2-MALT1は30°C)で培養する



アルカリミニプレップ

Solution I50 mM グルコース (MW 180)
 10 mM EDTA(pH 8.0)
 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II0.2 N NaOH
 1% SDS
Solution III3 M 酢酸カリウム
 1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心する
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かす


今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する


ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
1 kbp or 100bp マーカー3 ml
★DNAサンプル入力★入力
Lording Dyi7 ml
↓50 Vで60分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 µlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をする


ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

テーブルタグテーブルタグ2テーブルタグ
れお、中川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cyle
Anneling(Tm-5)°C1min
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 

松浪くん、横井川くんのやつ
下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
★Ex Taqばーじょん！
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cyle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜる
右に示したプログラムで反応を行う
(Tm-5)°C←のところは各自入力おねがいします！！
MgSO4とddH2Oの使用した量は各自で変更おねがいします！！
★KOD+ばーじょん！
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 


ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する

コンピテント細胞の作製

SOB培地(1 L)
bacto tryptone20 g
bacto yeast extract5 g
5M NaCl2 mL
2K KCl1.25 mL
↓上記の組成に従って試薬を計り、ビーカーに入れる
↓ddH2Oでtotal 990 mlにして、121°Cで20分オートクレーブ滅菌する
Transformation Buffer(TB)
PIPES1.5 g
CaCl2H2O1.1 g
KCl9.3 g
↓上記の組成に従って試薬を計り、ddH2O 400 mlに溶解する
↓5M KOHでpH 6.7～6.8に合わせる
↓MnCl2H2Oを5.45 g添加する
↓ddH2Oでtotal 500 mlにして、濾過滅菌し、4°Cで保存する

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