Team:KIT-Kyoto/ぷろとこる

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Revision as of 03:26, 18 September 2011

ぷろとこるうｐページ(^ω^)/

LB培地

bacto tryptone	10 g
bacto yeast evtract	5 g
NaCl	10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れる
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かす
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをして
↓121 ℃で20分オートクレーブ滅菌する

LBプレート

LB培地
bacto-agar	15 g/l

↓LB培地を作製する
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌する
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌する
↓65 ℃程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加える
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20～25 ml分注する
↓水平な所に置いて固まらせる

トランスフォーメーション

去年のコピペばーじょん☆
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍する
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 μlのコンピテント細胞を分注する
↓余ったコンピテント細胞は-80 ℃の冷凍庫に戻す
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42 ℃で45秒間熱ショックを与える
↓0.9 mlのSOC培地を加える
↓37 ℃で1時間、振りながら回復培養する
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく
↓37 ℃で一晩培養する

今年のシエロさんにもろたプリント☆
↓ligation後の反応液を全量、コンピテント細胞(大腸菌)へ加える
↓氷上で15分間冷やす
↓43 ℃で30秒間熱ショクを与える
↓氷上で10分間冷やす
↓SOCまたはLB(-)溶液を等量加えて、37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で30分間回復培養する
↓LB(+amp)プレートに塗る
↓37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で培養する

アルカリミニプレップ

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

去年のこぴぺ
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37 ℃で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37 ℃で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす
↓15,000 rpm、4 ℃で1分間遠心し、上清を捨てる
↓100 μlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁する
↓200 μlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 μlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心する
↓400 μlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる
↓900 μlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てる
↓1 mlの70%エタノールを加える
↓ 15,000 rpm、4 ℃で2分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓プラスミドDNAを30 μlのRNaseのはいったTEに溶かす

今年のミニプレ
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37 ℃(API2-MALT1は30 ℃)で一晩振とう培養する
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心し、上清を捨てる
↓100 μlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする
↓沈殿物を溶かした後、200 μlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓150 μlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない
↓氷上で5分間冷やす
↓15,000 rpm、4 ℃で10分間遠心する
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する
↓450 μlのイソプロパノールを加え、混ぜる
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓150～200 μlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする
↓2分間室温で放置する
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる
↓沈殿を10分～15分乾かす
↓RNaseのはいったTEを20 μl加えて37 ℃で培養する

ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとマーカーをゲルにのせる
↓75 Vで45分間電気泳動する
↓EtBrでゲルを40分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加える
↓42-50 °Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる(残りのエタノールを除くため)
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓30 µlのelution Buffer EBをカラムの中央に加える
↓1分間立たせておく
↓15,000 rpmで1分間遠心する
↓集めたDNAは1.5 mlチューブに入れて-20 °Cで保存する

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 <a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<BR>
-↓1 x TAEに溶かした低融点のアガロースゲルをつくる<BR>
+↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる<BR>
 ↓DNAとマーカーをゲルにのせる<BR>
 ↓75 Vで45分間電気泳動する<BR>